2016年1月，回國(guó)不滿半年的張余，在《中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心人員遴選申請(qǐng)書》里寫道：“申請(qǐng)人擬開展的工作是運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究葉綠體編碼的RNA聚合酶（PEP）的工作機(jī)理和調(diào)控機(jī)制?！?

當(dāng)期封面。受訪者供圖

8年后，張余團(tuán)隊(duì)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授周菲團(tuán)隊(duì)合作，解析了PEP的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并揭示了該葉綠體基因轉(zhuǎn)錄“機(jī)器”的“裝配部件”“裝配模式”“功能模塊”，為葉綠體光合作用的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用探索打下了基礎(chǔ)。相關(guān)研究成果3月1日以封面文章形式發(fā)表于《細(xì)胞》。

“植物學(xué)領(lǐng)域的前沿科學(xué)問題，很多都是生命科學(xué)的共性問題?！敝袊?guó)科學(xué)院院士、中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（以下簡(jiǎn)稱分子植物卓越中心）主任韓斌告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》，這項(xiàng)工作填補(bǔ)了RNA聚合酶（RNAP）領(lǐng)域的空白，是可以寫進(jìn)教科書的突破性進(jìn)展，將帶動(dòng)后續(xù)一系列應(yīng)用方面的探索。

領(lǐng)域里最有挑戰(zhàn)性的難題

如果將細(xì)胞比作一臺(tái)精密運(yùn)轉(zhuǎn)的電腦，基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器——RNAP則是轉(zhuǎn)錄過程中的“中央處理器（CPU）”，其重要性不言而喻?！斑z傳信息被存儲(chǔ)在基因組這塊‘硬盤’中，必須借助‘CPU’讀取細(xì)胞中的各類數(shù)據(jù)，并整合各方信號(hào)輸出指令，才能開始后續(xù)的生命活動(dòng)?！睆堄嘟忉?。

隨著對(duì)此類“CPU”認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，盡管生物種類繁多，RNAP卻十分保守。

幾十年間，科學(xué)家陸續(xù)解析了細(xì)菌、古菌、真核生物RNAP的結(jié)構(gòu)和工作機(jī)制。但對(duì)植物特有RNAP的解析進(jìn)展緩慢。直到近幾年，張余和分子植物卓越中心研究員王佳偉才合作闡明了植物特有的Pol IV結(jié)構(gòu)和機(jī)制。而PEP結(jié)構(gòu)遲遲不現(xiàn)“廬山真面目”。

事實(shí)上，僅PEP的鑒定發(fā)現(xiàn)就經(jīng)歷了32年。原因在于其結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜。“這是一個(gè)持續(xù)發(fā)現(xiàn)的過程?？赡苣骋荒臧l(fā)現(xiàn)某一蛋白是RNAP的亞基組分，過兩年又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)?！睆堄嗾f。

植物葉綠體的“祖先”是原核藍(lán)細(xì)菌。演化至今，葉綠體基因組變得“小而精”，轉(zhuǎn)錄葉綠體基因組的機(jī)器卻越發(fā)復(fù)雜。PEP在原核藍(lán)細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的基礎(chǔ)上，裝配了多個(gè)獨(dú)特的功能模塊，“身形”變?yōu)樵瓉淼?.5倍，其“裝配部件”數(shù)量變?yōu)樵瓉淼?倍。然而這些模塊在原核藍(lán)細(xì)菌中基本沒有原型，大多數(shù)“借”于真核細(xì)胞。

多年研究表明，葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器控制葉綠體的發(fā)育過程以及成熟葉綠體的基因表達(dá)，在調(diào)控植物光合作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用?！癙EP研究是領(lǐng)域內(nèi)最重要、最有挑戰(zhàn)性的。”王佳偉說。

科研是一場(chǎng)沒有硝煙的競(jìng)爭(zhēng)

回國(guó)后的8年間，張余團(tuán)隊(duì)聚焦細(xì)菌、酵母和植物的細(xì)胞核與細(xì)胞器RNAP，持續(xù)產(chǎn)出成果。但對(duì)于PEP的結(jié)構(gòu)解析，在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里都沒有進(jìn)展。

“最大的瓶頸是如何從葉綠體中純化豐度非常低的RNA聚合酶。我們嘗試了多種手段，都以失敗告終。”張余回憶，“比如我們嘗試沿用解析Pol IV時(shí)的一個(gè)方法，用擬南芥懸浮細(xì)胞去純化植物內(nèi)源蛋白，但目前擬南芥中葉綠體轉(zhuǎn)化的效率非常低，很難把穩(wěn)定的蛋白標(biāo)簽插入到葉綠體基因組中。”

2019年，德國(guó)馬普分子植物生理所所長(zhǎng)、德國(guó)科學(xué)院院士Ralph Bock在分子植物卓越中心作學(xué)術(shù)報(bào)告時(shí)，介紹了其在植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)和應(yīng)用領(lǐng)域的研究進(jìn)展。張余茅塞頓開，意識(shí)到可以在PEP的基因序列中加上一段DNA序列作為標(biāo)簽，再通過親和純化的方式，把PEP從復(fù)雜的組分中“拉”出來，從而獲得葉綠體基因轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)復(fù)合物。

于是，團(tuán)隊(duì)鎖定了葉綠體基因轉(zhuǎn)化效率較高的模式植物大葉煙草。“但是前期我們沒有種植煙草的經(jīng)驗(yàn)，剛開始種植就遇到了蚜蟲暴發(fā)，煙草一直長(zhǎng)不大，我們不得不天天用透明膠帶手工捕捉蚜蟲。最后通過對(duì)溫室和培養(yǎng)土滅菌才得以根治蟲害?！闭撐牡谝蛔髡?、分子植物卓越中心副研究員武霄仙回憶道。

直到2022年底，團(tuán)隊(duì)才建立了穩(wěn)定的純化流程，突破了PEP蛋白獲取瓶頸。然而，國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)十分激烈，陸續(xù)有幾個(gè)課題組在PEP純化及結(jié)構(gòu)解析方面取得了突破。

“我們當(dāng)時(shí)很緊張。”為了確保進(jìn)度，武霄仙還沒休完產(chǎn)假就回到實(shí)驗(yàn)室投入研究，經(jīng)常做實(shí)驗(yàn)做到半夜。而PEP復(fù)雜的結(jié)構(gòu)給數(shù)據(jù)處理帶來了挑戰(zhàn)。在獲得蛋白冷凍電鏡結(jié)構(gòu)后，武霄仙發(fā)現(xiàn)PEP蛋白的二維分類中存在很多“洞”和“犄角”，三維結(jié)構(gòu)也很陌生?！拔墨I(xiàn)報(bào)道PEP由藍(lán)細(xì)菌RNAP進(jìn)化而來，但是我找不到一點(diǎn)藍(lán)細(xì)菌RNAP的影子，一度以為自己解析了一個(gè)‘雜蛋白’?！?

最終，團(tuán)隊(duì)從較為熟悉的亞基入手，基于前期文獻(xiàn)和AlphaFold結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將PEP亞基放置到了準(zhǔn)確位置，并很快開始撰寫論文。

2023年6月，英國(guó)Michael Webster課題組在會(huì)議中報(bào)告了白芥PEP蛋白冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的相關(guān)進(jìn)展。最后Webster課題組和張余團(tuán)隊(duì)商量“背靠背”共同發(fā)表。

“在這8年時(shí)間里，我們之所以能夠堅(jiān)持研究下去，得益于分子植物卓越中心營(yíng)造的比較寬松、讓青年人才能夠潛心啃‘硬骨頭’的環(huán)境?！睆堄鄰?qiáng)調(diào)。

補(bǔ)上最后一塊拼圖

與原核藍(lán)細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器相比，PEP一共具有20個(gè)“裝配部件”（蛋白亞基），其中14個(gè)是其特有的。張余團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，它們通過“套娃模型”進(jìn)行裝配：藍(lán)細(xì)菌來源的催化模塊包含6個(gè)“裝配部件”，位于復(fù)合物的核心層；支架模塊由7個(gè)部件組成，位于中間層，一方面可以穩(wěn)定催化模塊，另一方面為其他模塊提供結(jié)合位點(diǎn)；另有7個(gè)部件位于最外層，具有不同的功能特性。

在“套娃”最外層，分布著3個(gè)不同模塊：保護(hù)模塊包括兩個(gè)蛋白亞基，保護(hù)PEP免受葉綠體中超氧化物的氧化攻擊；RNA模塊包括1個(gè)亞基，能夠序列特異性地結(jié)合RNA；調(diào)控模塊由4個(gè)亞基組成，可能參與基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的活性調(diào)控。其中，催化模塊由葉綠體基因組編碼，蛋白亞基起源于藍(lán)細(xì)菌；其他模塊由細(xì)胞核基因組編碼，大部分蛋白亞基起源于真核細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)翻譯后運(yùn)輸至葉綠體完成組裝。

“這是一個(gè)非常巧妙的組裝模式，能夠保證細(xì)胞核控制葉綠體的基因表達(dá)?！睆堄嘟忉專斑@些亞基需要在細(xì)胞核中完成轉(zhuǎn)錄、在細(xì)胞質(zhì)中完成翻譯，再運(yùn)輸?shù)饺~綠體中，同催化模塊組裝成完整的復(fù)合物，此時(shí)PEP才能夠發(fā)揮功能。”

張余指出，葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器結(jié)構(gòu)被解析出來，意味著三域生物所有RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)類型均被闡明，“最后一塊拼圖”終于被補(bǔ)上。

該研究在基礎(chǔ)研究層面，為進(jìn)一步探索葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的工作模式、理解葉綠體的基因表達(dá)調(diào)控方式打下了基礎(chǔ)；在應(yīng)用層面，為改造葉綠體基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、增加光合作用復(fù)合物的基因表達(dá)、提高光合作用效率打下了基礎(chǔ)；在合成生物學(xué)應(yīng)用層面，則可助力重組疫苗、重組蛋白藥物和天然產(chǎn)物的生產(chǎn)。

“我們只是把研究葉綠體基因轉(zhuǎn)錄領(lǐng)域的門推開了。在整個(gè)轉(zhuǎn)錄過程中，還有很多其他蛋白和小分子參與，需要在多個(gè)層面進(jìn)一步開展研究。”張余說。

（《中國(guó)科學(xué)報(bào)》見習(xí)記者 江慶齡，本文刊于《中國(guó)科學(xué)報(bào)》2024-03-01 第1版 要聞）