目前關(guān)于新冠病毒（SARS-CoV-2）的基因組調(diào)查數(shù)據(jù)表明，病毒存在著大量的單核苷酸變異(SNVs)，此前尚無(wú)研究表明突變與病毒致病性的功能改變直接相關(guān)。

然而，李蘭娟院士團(tuán)隊(duì)的最新研究提出了直接證據(jù)，證明目前發(fā)生在新冠病毒基因組中的突變具有影響病毒致病性的功能潛力。李蘭娟團(tuán)隊(duì)提示：疫苗和藥物的開(kāi)發(fā)需要考慮到這些累積突變，尤其是始祖突變的影響，以避免潛在的缺陷。

在最新的一份研究中，來(lái)自浙江大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)報(bào)告了11例新冠患者來(lái)源的病毒分離株的功能特征，它們都至少有一個(gè)突變。重要的是，當(dāng)感染Vero-E6細(xì)胞時(shí)，這些病毒分離株在細(xì)胞病變效應(yīng)和病毒載量方面表現(xiàn)出顯著差異，差異高達(dá)270倍。

當(dāng)?shù)貢r(shí)間4月19日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院、浙江省胰腺病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)在醫(yī)學(xué)預(yù)印本平臺(tái)medRxiv在線發(fā)表了一篇研究論文“Patient-derived mutations impact pathogenicity of SARS-CoV-2”。該論文通訊作者為中國(guó)工程院院士、國(guó)家衛(wèi)健委高級(jí)別專(zhuān)家組成員李蘭娟教授，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院研究員蔣超，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室吳南屏教授和鄭敏教授。

目前的研究認(rèn)為，跨膜刺突糖蛋白（S蛋白）介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，S蛋白根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)功能又被分為兩個(gè)功能單位，即S1和S2蛋白亞基。其中S1負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，S2負(fù)責(zé)病毒和細(xì)胞膜融合。新冠病毒和SARS-CoV都使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）進(jìn)入靶細(xì)胞。ACE2在人鼻上皮細(xì)胞和肺、精原細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、胃、十二指腸和直腸上皮細(xì)胞中表達(dá)。

論文提到，S蛋白的受體結(jié)合域（RBD）是β冠狀病毒中最具變異性的基因組部分，S蛋白的某些位點(diǎn)可能會(huì)受到正向選擇。不過(guò)，盡管新冠病毒具有大量的變異性，一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題仍然是：這些突變是否對(duì)新冠病毒的致病性有任何真正的功能影響？

研究人員認(rèn)為，上述問(wèn)題對(duì)理解病毒感染機(jī)制至關(guān)重要，并指導(dǎo)藥物和疫苗的開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略，為應(yīng)對(duì)疫情大流行下一階段做準(zhǔn)備。為了解決這一問(wèn)題，研究人員從浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的患者中分離出11株新冠病毒毒株。

研究人員在Novaseq 6000平臺(tái)上對(duì)11株病毒分離株進(jìn)行超深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)病毒分離株的編碼序列分別存在1-5個(gè)突變，同樣也觀察到混合群體（代表病毒準(zhǔn)種，Quasi-species）。他們總共鑒定出33個(gè)突變（包括在混合群體中觀察到的10個(gè)突變），根據(jù)與GISAID在2020年3月24日提供的1111個(gè)基因組序列的比較，其中19個(gè)是新的突變。

研究人員還用11株病毒分離株感染了Vero-E6細(xì)胞，并定量評(píng)估了它們?cè)诟腥竞螅≒.I.）1、2、4、8、24和48小時(shí)的病毒載量，以及在感染后48和72小時(shí)的病毒性細(xì)胞病理效應(yīng)（CPE）。

他們的研究結(jié)果表明，在感染Vero-E6細(xì)胞時(shí)，觀察到的突變會(huì)對(duì)病毒載量和細(xì)胞病理效應(yīng)產(chǎn)生直接影響，差異最高達(dá)270倍。這一發(fā)現(xiàn)表明，研究中觀察到的病毒突變，可以顯著影響新冠病毒的致病性，而這種突變?cè)谌蚋鞯夭杉牟《径局曛卸伎赡艽嬖凇?

總體而言，這項(xiàng)研究提供了直接證據(jù)，證明目前發(fā)生在新冠病毒基因組中的突變具有影響病毒致病性的功能潛力。研究人員提醒，除了不斷積累的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)外，還應(yīng)盡可能在細(xì)胞水平上進(jìn)行病毒監(jiān)測(cè)。最后，與流感類(lèi)似，藥物和疫苗的開(kāi)發(fā)雖然緊迫，但也需要考慮到這些累積突變，尤其是始祖突變的影響，以避免潛在的缺陷。

患者流行病學(xué)病史

本研究中涉及的11例患者的樣本收集于國(guó)內(nèi)疫情暴發(fā)的早期階段，時(shí)間為2020年1月22日至2020年2月4日。

11例患者中有10例與武漢有明確關(guān)系，這11人中有5人確診前在武漢工作或旅行，另外5人與居住在武漢的人有過(guò)密切接觸，剩下的1人與新冠患者有過(guò)接觸。值得注意的是，患者ZJU-4、ZJU-5、ZJU-9均參加了有武漢同事出席的同一個(gè)商務(wù)會(huì)議。

因此，根據(jù)這11例患者的流行病學(xué)歷史，他們構(gòu)成了第一代和第二代感染病例。

11例患者中男性8例，女性3例，年齡4個(gè)月至71歲不等。除1例患者外，其余所有患者均有中度或更嚴(yán)重的癥狀，3例有合并癥，1例需要ICU治療。

截至該論文撰寫(xiě)，所有病人均已康復(fù)。

11例患者中采集的病毒分離株中存在多種突變

為了評(píng)估這11株病毒分離株的突變譜，研究人員在Illumina Novaseq 6000平臺(tái)上對(duì)分離的病毒基因組RNA進(jìn)行了超深度測(cè)序，平均每個(gè)樣本產(chǎn)生2.45億個(gè)讀數(shù)/67.16 Gb。

他們總共鑒定出33個(gè)突變（包括在混合群體中觀察到的10個(gè)突變），根據(jù)與GISAID在2020年3月24日提供的1111個(gè)基因組序列的比較，其中19個(gè)是新的突變。

具體來(lái)說(shuō)，在ZJU-1中發(fā)現(xiàn)了G11083T和G26144T，這兩種突變都被認(rèn)為是一個(gè)大群體病毒的始祖突變。ZJU-2和ZJU-8中發(fā)現(xiàn)了C8782T和T28144C突變，這兩種突變被認(rèn)為是另外一個(gè)大群體病毒分離株的始祖突變。

ZJU-2、ZJU-5、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11這5個(gè)病毒分離株中均發(fā)現(xiàn)了T22303G突變，ZJU-5和ZJU-9在一次商業(yè)會(huì)議中暴露于相同的潛在感染源。值得一提的是，此前僅在澳大利亞分離得到的病毒株中鑒定出具有T22303G突變。

值得注意的是，和ZJU-5、ZJU-9參加同一會(huì)議的患者ZJU-4的病毒分離株有一個(gè)新的突變A22301C，它在蛋白水平上（S蛋白中的S247R）導(dǎo)致了與T22303G相同的錯(cuò)義突變。

最后，ZJU-11在ORF7b基因中有4個(gè)突變，其中3個(gè)是連續(xù)的，并在蛋白水平上引入了2個(gè)突變。

值得注意的是，研究人員認(rèn)為，盡管GISAID中的序列數(shù)據(jù)對(duì)跟蹤病毒的個(gè)體間變異非常有幫助，但我們?nèi)匀粚?duì)病毒的個(gè)體內(nèi)進(jìn)化動(dòng)力學(xué)知之甚少。例如，在ZJU-4和ZJU-10中，兩個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)的等位基因頻率分布非常相似，這表明這兩個(gè)位點(diǎn)可能是相關(guān)聯(lián)的，提示在病毒種群中至少存在兩種單倍型。

總的來(lái)說(shuō)，盡管在這項(xiàng)研究中只分析了11株來(lái)自病人的病毒株，研究人員仍觀察到突變多樣性，包括目前在全球傳播的不同主要病毒簇的幾種基本突變。這種多樣性的突變譜與它們相對(duì)較早的采樣時(shí)間和相對(duì)接近武漢市是一致的。不過(guò)，由于樣本量有限，武漢地區(qū)早期病毒的完全變異多樣性至今仍不清楚。

研究人員討論指出，在11個(gè)病毒分離株中發(fā)現(xiàn)了多種突變，包括目前感染全球人口的兩大類(lèi)病毒的兩組始祖突變。此外，盡管取樣日期相對(duì)較早，31個(gè)已鑒定的突變中有19個(gè)是新的，這表明病毒株的真正多樣性在很大程度上仍未得到充分認(rèn)識(shí)。

另外，T22303G突變?cè)?個(gè)病毒株中均觀察到，這個(gè)特定的突變?cè)谠缙谝咔橹幸呀?jīng)出現(xiàn)，并可能在相當(dāng)數(shù)量的武漢人身上都有。這可能是由于突變的始祖效應(yīng)，在這種效應(yīng)情況下，T22303G突變?cè)谠缙诓](méi)有從中國(guó)傳播出去。

值得注意的是，ZJU-11的三核苷酸突變是出人意料的。研究人員注意到，這個(gè)特殊的病毒分離株在研究中的病毒載量和CPE測(cè)定中都顯得非?！皬?qiáng)有力”，其來(lái)源病人也非常罕見(jiàn)地持續(xù)45天新冠陽(yáng)性，最近從醫(yī)院出院。

他們認(rèn)為，研究這種三核苷酸突變的功能影響將是非常有趣的。值得注意的是，在目前的數(shù)據(jù)庫(kù)中，另一個(gè)三核苷酸突變（G28881A, G2882A和G28883C）已被鑒定出，也導(dǎo)致了兩個(gè)蛋白水平的錯(cuò)義突變。

研究人員還提醒一點(diǎn)，與最近報(bào)道的不能從糞便樣本中獲得活病毒相反，這項(xiàng)研究中有3個(gè)病毒分離株是從糞便樣本中提取的，研究表明新冠病毒能夠在糞便樣本中可以復(fù)制。

系統(tǒng)發(fā)育分析揭示不同的進(jìn)化史

為了從已有的新冠病毒測(cè)序數(shù)據(jù)中了解11株病毒分離株的系統(tǒng)發(fā)育背景，研究人員從GISAID（下載于2020年3月21日）獲得了725個(gè)高質(zhì)量、高覆蓋的新冠病毒基因組，其中包括2013年在云南中華菊頭蝠中采集的RaTG13病毒株和廣東穿山甲病毒株作為外群。

研究人員構(gòu)建了一個(gè)包含736個(gè)病毒序列的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與GISAID上更新的系統(tǒng)發(fā)育分析基本一致。

研究觀察到相當(dāng)多的始祖突變。具體來(lái)說(shuō)，在這項(xiàng)系統(tǒng)發(fā)育分析中，研究人員注意到以下三個(gè)最大的簇：第一、在231個(gè)病毒序列中發(fā)現(xiàn)三個(gè)核苷酸突變C241T、C14408T和A23403G（S-D614G簇），大部分在歐洲分離獲得；第二、在208個(gè)病毒序列中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)核苷酸突變C8782T和T28144C（ORF8-L84S簇），在這項(xiàng)分析中它們不是單源的(圖2A和圖S3)。然而，在ORF8-L84S簇內(nèi)的92個(gè)基因組序列上可以觀察到明顯的單源亞支（subclade），主要由來(lái)自美國(guó)西雅圖的病毒序列組成（ORF8-L84S-USA-WA-clade）；第三、在34個(gè)病毒序列中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)核苷酸突變G11083T (ORF1a中的L3606F)和G26144T (ORF3a中的G251V)，其中大部分來(lái)自荷蘭和英國(guó)。

研究人員提到，還可以觀察到幾個(gè)由不同的始祖突變集定義的較小的單源簇。例如：第一、31個(gè)病毒序列發(fā)現(xiàn)了G1937A (ORF1a中的V378I)突變；第二、12個(gè)病毒序列中發(fā)現(xiàn)了G1440A和G2891A突變，導(dǎo)致了ORF1a基因的G392D和A876T突變，大部分來(lái)自德國(guó)或荷蘭；第三、8個(gè)基因組序列中發(fā)現(xiàn)了C15325T和C29303T突變，導(dǎo)致了N基因的P344S突變，來(lái)自中國(guó)或日本。

研究人員將11株病毒分離株整合到系統(tǒng)發(fā)育分析中，它們分散在整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育空間中。ZJU-1與ORF1a-L3606F和ORF3a-G251V組聚類(lèi)，它同時(shí)具有這兩種典型的突變。另一方面，ZJU-2與ZJU-8和ORF8-L84S聚類(lèi)，它們都有兩個(gè)始祖突變。由于上述T22303G突變，ZJU-9和ZJU-11與澳大利亞的一個(gè)分離株聚類(lèi)。其他毒株則或者突變較少，或者沒(méi)有與任何已知的大規(guī)模群體聚集的新突變，這反映了這11個(gè)樣本的廣泛多樣性。

綜上所述，研究人員認(rèn)為，一些單源病毒群確實(shí)表現(xiàn)出明顯的地理模式（特別是歐洲和美國(guó)），但這可能是由于在大流行初期發(fā)生各自突變的“始祖效應(yīng)”。

感染Vero-E6細(xì)胞時(shí)，病毒拷貝數(shù)和細(xì)胞病理效應(yīng)有顯著差異

目前來(lái)看， COVID-19患者表現(xiàn)出多種臨床癥狀，流行病學(xué)研究表明，臨床結(jié)果受個(gè)體年齡、并發(fā)癥和其他潛在未知參數(shù)的嚴(yán)重影響。為了檢測(cè)患者來(lái)源的新冠病毒分離株的突變影響，研究人員進(jìn)行了體外感染試驗(yàn)。

研究人員首先檢測(cè)了病毒分離株是否能如預(yù)期那樣成功地與Vero-E6細(xì)胞結(jié)合，并以S蛋白形成的標(biāo)志性“皇冠”來(lái)直觀識(shí)別病毒顆粒。然后，他們用所有11個(gè)病人來(lái)源的病毒分離株感染Vero-E6細(xì)胞，并在感染后1、2、4、8、24和48小時(shí)收集細(xì)胞。在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)分別取細(xì)胞的DIC顯微照片來(lái)評(píng)估CPE。

他們使用針對(duì)ORF1a、E和N基因的特異性實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來(lái)檢測(cè)新冠病毒的存在。循環(huán)閾值Ct用于量化病毒載量，較低的值表示較高的病毒載量。由于這三個(gè)基因的結(jié)果高度一致，他們只討論ORF1a基因的結(jié)果。

簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，所有病毒分離株樣本感染后1、2、4小時(shí)的Ct值保持平穩(wěn)，僅有小的波動(dòng)。在這些較早的時(shí)間點(diǎn)上，病毒粒子結(jié)合入侵細(xì)胞，病毒復(fù)制在這個(gè)階段很少發(fā)生。

在感染后8小時(shí)，研究人員觀察到ZJU-6、ZJU-7、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11的Ct值顯著下降，即意味著病毒載量增加。感染后24小時(shí)，觀察到除了ZJU-2和ZJU-7外，所有病毒分離株的Ct值都顯著下降，其中一些病毒分離株，即ZJU-10和ZJU-11，下降速度比其他病毒快得多。感染后48小時(shí)，除ZJU-10和ZJU-11外，所有病毒分離株均有小幅度下降，研究人員推測(cè)ZJU-10和ZJU-11在24小時(shí)時(shí)均已趨于穩(wěn)定。

值得注意的是，感染后24小時(shí)，ORF-8-L84S簇成員ZJU-2和ZJU-8（大部分來(lái)自美國(guó)華盛頓州西雅圖）的病毒載量顯著降低。另一方面，與S-D614G分支(主要在歐洲發(fā)現(xiàn))同簇的ZJU-1病毒載量是ZJU-2和ZJU-8的19倍。此外，在感染后24小時(shí)，ZJU-10和ZJU-2的病毒載量相差近270倍。

論文提到，這些差異在48小時(shí)變得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在分析基因E和N的數(shù)據(jù)時(shí)是可重復(fù)的。因此，研究人員認(rèn)為，不同的病毒分離株在感染Vero-E6細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出顯著的病毒載量變化，這是由其基因組的不同突變決定的。

接下來(lái)，研究人員檢驗(yàn)了病毒載量增加是否會(huì)導(dǎo)致更多細(xì)胞死亡。在感染后48小時(shí)和72小時(shí)顯微鏡下觀察這些細(xì)胞系，CPE或細(xì)胞死亡率與病毒載量數(shù)據(jù)高度一致，表明病毒載量越高，細(xì)胞死亡率越高。

他們?cè)谟懻摥h(huán)節(jié)提到，由于患者表現(xiàn)出的臨床癥狀極為多樣，在患者中建立基因型與表型的聯(lián)系將是非常困難的。體外細(xì)胞系提供了一個(gè)理想的系統(tǒng)，以檢查不同的分離病毒株突變的影響。

他們認(rèn)為，雖然Vero-E6細(xì)胞系并非來(lái)源于人，但Vero-E6細(xì)胞系的ACE2蛋白與人的ACE2蛋白高度相似，直接證明了新冠病毒可以感染該細(xì)胞系。