新冠大流行威脅著全球公共衛(wèi)生。為防控新冠疫情，人類迫切需要疫苗。來自中國科研團隊研發(fā)了名為BBIBP-CorV的新冠滅活疫苗，已在動物實驗顯示出了巨大的潛力：該疫苗高效、安全，在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長類動物(食蟹猴猴子和恒河猴)體內(nèi)均能誘導(dǎo)高水平的中和抗體滴度，2μg/劑便能提供針對新冠病毒的高效保護。同時，該候選疫苗是國內(nèi)開發(fā)的第二個重要滅活疫苗，增加了國內(nèi)的候選疫苗選擇。

以上成果來自當(dāng)?shù)貢r間6月6日國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《細胞》（CELL）在線發(fā)表的重磅論文：《開發(fā)候選滅活疫苗BBIBP-CorV，對SARS-CoV-2能提供有效保護》（Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2）。

該論文通訊作者為中科院院士、中疾控主任高福、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所所長秦川、中國疾控中心病毒病所應(yīng)急技術(shù)中心主任譚文杰、清華大學(xué)教授婁智勇、中國食品藥品檢定研究院李長貴研究員、中國疾控中心生物安全首席專家、病毒病所黨委書記武桂珍等。

研究團隊來自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司、中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所、國家人類疾病動物模型資源中心、國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心、新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室、清華大學(xué)等。

研究者詳述了SARS-CoV-2滅活候選疫苗(BBIBP-CorV)的實驗性生產(chǎn)，該疫苗在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長類動物(食蟹猴猴子和恒河猴)體內(nèi)均能誘導(dǎo)高水平的中和抗體滴度，以提供對SARS-CoV-2的保護。在恒河猴的氣管內(nèi)免疫接種中，研究使用2μg/劑量的BBIBP-CorV便可提供了對SARS-CoV-2的高效保護，同時沒有檢測到抗體依賴性增強（ADE）感染。此外，BBIBP-CorV在疫苗生產(chǎn)中表現(xiàn)出高效的生產(chǎn)力和良好的遺傳穩(wěn)定性。

與SARS-CoV和MERS-CoV相比，SARS-CoV-2似乎傳播更快，導(dǎo)致對疫苗的迫切需求。迄今為止，三種候選疫苗(包括一種滅活疫苗、一種腺病毒載體疫苗和一種DNA疫苗)被報道以不同的效果保護恒河猴對抗SARS-CoV-2。滅活疫苗廣泛應(yīng)用于新發(fā)傳染病的預(yù)防，其研制速度較快，針對新冠病毒的預(yù)防具有較好的開發(fā)前景。值得注意的是，新出現(xiàn)的證據(jù)顯示，SARS-CoV感染的可能存在抗體依賴性增強(ADE)，提示研制冠狀病毒疫苗時應(yīng)特別重視安全性評價。

國內(nèi)的首個滅活新冠疫苗來自國藥集團中國生物。國藥集團中國生物4月14日發(fā)布消息，公司旗下新型冠狀病毒滅活疫苗獲得臨床試驗后，一期臨床已在河南焦作地區(qū)開展。

另一方面，由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所陳薇院士團隊和中國康希諾（CanSino）公司聯(lián)合開發(fā)的腺病毒5型（Ad5）載體疫苗也取得了重大進展。當(dāng)?shù)貢r間5月22日晚間，頂級醫(yī)學(xué)期刊《柳葉刀》（The Lancet）刊發(fā)一篇論文，題為“重組腺病毒5型載體COVID-19疫苗的安全性，耐受性和免疫原性：劑量遞增，開放標(biāo)簽，非隨機，首次人類試驗”。陳薇等研究人員報告了在中國健康成年人中使用的Ad5載體COVID-19疫苗在接種后28天內(nèi)的1期臨床數(shù)據(jù)，初步評估疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。

疫苗設(shè)計和生產(chǎn)

研究團隊從3名新冠住院患者的支氣管肺泡灌洗樣本及咽喉拭子中分離出3株SARS-CoV-2毒株，用于建立SARS-CoV-2滅活候選疫苗的臨床前體外中和攻毒動物模型。3株新冠毒株分別是：19 ncov-cdc-tan-hb02 (HB02), 19 ncov-cdc-tan-strain03 (CQ01)和19 ncov-cdc-tan-strain04 (QD01)。這3株毒株散布在系統(tǒng)發(fā)育樹的不同位置，表明其對SARS-CoV-2具有較好的代表性。

值得注意的是，所有這些毒株都是從Vero細胞中分離出來的，并已獲得世界衛(wèi)生組織的疫苗生產(chǎn)認證。這些Vero細胞通過患者的咽喉拭子感染，而不是其他細胞系，以防止在病毒培養(yǎng)和分離過程中可能發(fā)生的突變。高效增殖和高遺傳穩(wěn)定性是研制滅活疫苗的關(guān)鍵。他們首先發(fā)現(xiàn)在三種病毒株中，HB02株的88個Vero細胞復(fù)制效果最佳，產(chǎn)生的病毒產(chǎn)量最高(圖1a)。因此，研究者選擇HB02株進一步開發(fā)滅活SARS-CoV-2疫苗(BBIBP-CorV)。HB02株和其他從國內(nèi)和國際來源的SARS CoV-2毒株的全基因組序列的比較表明：HB02毒株與其他病毒株同源，并證明了主要保護性抗原(刺突蛋白質(zhì))有100%的同源性。這說明具有廣泛對抗各種SARS-CoV-2毒株的潛力(補充圖1和補充圖2)。為了獲得適于高產(chǎn)的病毒培養(yǎng)基，研究者對HB02株進行了純化，并在Vero細胞中傳代產(chǎn)生了P1病毒培養(yǎng)基。將P1培養(yǎng)基在Vero細胞上進行適應(yīng)性培養(yǎng)、傳代和擴增。研究者將經(jīng)過7代適應(yīng)化的毒株(BJ-P-0207)作為生產(chǎn)疫苗的原種子(BJ-P1)。為評價遺傳穩(wěn)定性，研究者對其再傳代3次，得到P10病毒培養(yǎng)基。通過深度測序分析，我們對HB02株和P10株進行了全基因組測序，結(jié)果顯示它們的序列同源性大99.95%。此外，在P10原料病毒的全序列中，包括弗林分裂位點附近也沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸變異，這些結(jié)果表明HB02毒株具有較高的遺傳穩(wěn)定性，有利于進一步的發(fā)展。

為了高效制造，研究者建立了基于新型籃式反應(yīng)器載體的BBIBP-CorV的原料生產(chǎn)策略(圖1b)。對Vero細胞中P7培養(yǎng)基的生長動力學(xué)分析顯示，培養(yǎng)基病毒能夠有效復(fù)制，在感染后48-72小時(hpi)達到最高滴度超過7.0 log10 CCID50，感染多重度(MOI)為0.01-0.3(圖1c)。為了滅活病毒產(chǎn)生，研究者在2-8℃，以1:40的比例將丙酸內(nèi)酯與收獲的病毒溶液充分混合。病毒的3批滅活消除了病毒的感染性，驗證了滅活過程良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性(圖1d)。Western-blotting分析顯示，疫苗庫中含有病毒結(jié)構(gòu)蛋白(保護性抗原)(圖1e)。負染色的電子顯微鏡圖像顯示橢圓形病毒顆粒，直徑約為100 nm(圖1f)。

BBIBP-CorV的免疫原性

為評估BBIBP-CorV的免疫原性，研究者采用不同免疫方案和不同劑量(2、4、8μg/劑)疫苗注射BALB/c小鼠。

單劑量免疫組在第0天(D0)以三種劑量腹腔給藥，分別是高(8 μg/劑)、中(4μg/劑)、低劑量(2μg/劑)的BBIBP-CorV，觀察注射后7、14、21、28天中和抗體(NAb)水平。結(jié)果表明，高、中、低劑量組的血清轉(zhuǎn)化速率在免疫后7天都達到100%，同時免疫效果與時間相關(guān)(圖2,補充表1) 。低、中劑量組的中和抗體水平在7、14和21天顯示顯著的變化，但21天到28天之間無顯著差異。在高劑量組中，僅在7 、14天觀察到顯著變化(圖2a)。

雙劑免疫組采用不同免疫方案(第0天/第7天、第0天/第14天、第0天/第21天分別進行免疫)。雙劑量免疫中的高、中、低劑量組在第二次免疫后7天的血清陽性達到100%(圖2 b,補充表1)。高、中劑量的雙劑免疫方案的免疫原性明顯高于單劑量免疫方案。采用第0天/第21天方案的第二次免疫后7天，其中和抗體水平最高。

研究者還測試了三劑免疫程序的免疫原性。他們在0天、7天和時14 天在小鼠腹腔接種三種劑量的疫苗，分別是高(8μg /劑)、中(4μg /劑)或低(2μg /劑)疫苗 (圖2c)。在第7、14、21、28天測定各組的中和抗體水平，在第一次免疫后第7天，三組血清轉(zhuǎn)化率均達到100%(圖2c，補充表1)。

結(jié)果顯示，三劑 (0天/7天/14天)免疫接種方案在第28天時的中和抗體水平，均高一劑免疫接種方案(圖2a和2c)。此外，他們分析了單劑、雙劑(0天/21天)和3劑(0天/7天/ 14天)免疫接種小鼠采用高、中、低劑量疫苗的中和抗體水平，并在第一次免疫后的28天檢測中和抗體水平，以保持相同的起止點。結(jié)果顯示，三劑量(0天/7天/14天)免疫接種方案的免疫原性高于單劑量和雙劑量免疫接種方案(圖2d)。

接下來他們在兔子、豚鼠、大鼠和小鼠等不同的動物模型中測量BBIBP-CorV的免疫原性。采用單劑量(D0)免疫接種方案對動物進行高劑量(8μg/劑)、中劑量(4μg/劑))和低劑量(2μg/劑))疫苗免疫，免疫后21天測定中和抗體水平。結(jié)果表明BBIBP-CorV具有良好的免疫原性，免疫后21天在所有動物模型中血清轉(zhuǎn)化率達到100%,(圖2 e,補充表1)。在三劑(0天 / 7天 / 14天)免疫組，食蟹猴、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠接種高(8μg /劑量)中(4μg /劑量)或低(2μg /劑量)劑量的疫苗。免疫后21天在所有動物模型中血清轉(zhuǎn)化率達到100%。第一次免疫后21天的中和抗體水平表明，在兔和豚鼠模型中三劑(0天/7天/14天)免疫程序的高、中、低劑量下，均高于單劑(0天)免疫程序 (圖2 e 2 f,補充表1)。

非人靈長類動物模型中的保護作用

研究團隊評估了BBIBP-CorV對恒河猴的免疫原性和保護作用。

所有的恒河猴在第0天（D0）和第14天（D14）免疫2次。安慰劑組肌肉注射生理鹽水，兩組實驗組肌肉注射低劑量（2μg/劑）或高劑量（8μg/劑）BBIBP-CorV（圖3a）。病毒攻毒前，低劑量組和高劑量組的NAb GMT分別達到215和256(圖3b)。在D24（第二次免疫后第10天），所有恒河猴在麻醉下經(jīng)氣管注射l06 TCID50的SARS-CoV-2。病毒感染后0 至7天，接種組和安慰劑組的體溫在范圍內(nèi)波動（圖3c，補充圖4a）。

另外,恒河猴在攻毒后血清生化參數(shù)保持不變（補充圖3）,這一結(jié)果表明,接種BBIBP-CorV不會在血清生化參數(shù)方面顯示出副作用。

接下來研究團隊用RT-PCR測定了恒河猴咽喉和肛門拭子的病毒載量。結(jié)果顯示，所有安慰劑組恒河猴在攻毒后整個評估期間均顯示并維持高病毒載量（圖3d、3e，補充圖4b和4c）。

低劑量組恒河猴咽喉拭子病毒載量則在5dpi時達到峰值（5.33 log10拷貝/毫升），7 dpi時下降至1.12 log10拷貝/毫升，明顯低于安慰劑組。值得注意的是，低劑量組的4只恒河猴中有3只在7 dpi時已無法檢測病毒載量。而高劑量組4只恒河猴咽喉拭子病毒載量均為陰性。另外，高劑量組4只恒河猴中的2只肛門拭子也未檢測到病毒載量。

7 dpi時，研究團隊對所有動物實施了安樂死，以確定肺組織中的病毒載量并進行病理檢查（圖3f、3g）。在低劑量和高劑量組中，所有恒河猴在任何肺葉中均未檢測到病毒載量，這與安慰劑組的結(jié)果有顯著差異（圖3f）。安慰劑組在左肺、右肺和右副肺檢測到高病毒載量，病理組織學(xué)分析為嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎。

然而值得注意的是，在安慰劑組的7個肺葉切片中，只有3個被檢測出有感染。論文指出，這可能是因為病毒在肺葉中的感染是動態(tài)變化的。

總的來說，接種BBIBP-CorV疫苗后，所有恒河猴的肺均正常，少數(shù)肺葉有局部輕度組織病理學(xué)改變（圖3g），這說明接種BBIBP-CorV疫苗可有效阻斷猴子SARS-CoV-2感染。

7dpi時，接受安慰劑治療的恒河猴產(chǎn)生低水平的NAb，滴度為1:16，而高劑量組NAb水平最高可達1:2048（平均1:860），低劑量組NAb水平最高達1:1024（平均1:512）（圖3b）。研究指出，這些結(jié)果表明，低劑量和高劑量的BBIBP-CorV對恒河猴SARS-CoV-2具有高效的保護作用，且沒有觀察到抗體依賴性增強感染。