新冠大流行威脅著全球公共衛(wèi)生。為防控新冠疫情，人類迫切需要疫苗。來自中國科研團(tuán)隊(duì)研發(fā)了名為BBIBP-CorV的新冠滅活疫苗，已在動物實(shí)驗(yàn)顯示出了巨大的潛力：該疫苗高效、安全，在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長類動物(食蟹猴猴子和恒河猴)體內(nèi)均能誘導(dǎo)高水平的中和抗體滴度，2μg/劑便能提供針對新冠病毒的高效保護(hù)。同時(shí)，該候選疫苗是國內(nèi)開發(fā)的第二個(gè)重要滅活疫苗，增加了國內(nèi)的候選疫苗選擇。

以上成果來自當(dāng)?shù)貢r(shí)間6月6日國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》（CELL）在線發(fā)表的重磅論文：《開發(fā)候選滅活疫苗BBIBP-CorV，對SARS-CoV-2能提供有效保護(hù)》（Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2）。

該論文通訊作者為中科院院士、中疾控主任高福、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所所長秦川、中國疾控中心病毒病所應(yīng)急技術(shù)中心主任譚文杰、清華大學(xué)教授婁智勇、中國食品藥品檢定研究院李長貴研究員、中國疾控中心生物安全首席專家、病毒病所黨委書記武桂珍等。

研究團(tuán)隊(duì)來自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司、中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所、國家人類疾病動物模型資源中心、國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心、新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、清華大學(xué)等。

研究者詳述了SARS-CoV-2滅活候選疫苗(BBIBP-CorV)的實(shí)驗(yàn)性生產(chǎn)，該疫苗在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長類動物(食蟹猴猴子和恒河猴)體內(nèi)均能誘導(dǎo)高水平的中和抗體滴度，以提供對SARS-CoV-2的保護(hù)。在恒河猴的氣管內(nèi)免疫接種中，研究使用2μg/劑量的BBIBP-CorV便可提供了對SARS-CoV-2的高效保護(hù)，同時(shí)沒有檢測到抗體依賴性增強(qiáng)（ADE）感染。此外，BBIBP-CorV在疫苗生產(chǎn)中表現(xiàn)出高效的生產(chǎn)力和良好的遺傳穩(wěn)定性。

與SARS-CoV和MERS-CoV相比，SARS-CoV-2似乎傳播更快，導(dǎo)致對疫苗的迫切需求。迄今為止，三種候選疫苗(包括一種滅活疫苗、一種腺病毒載體疫苗和一種DNA疫苗)被報(bào)道以不同的效果保護(hù)恒河猴對抗SARS-CoV-2。滅活疫苗廣泛應(yīng)用于新發(fā)傳染病的預(yù)防，其研制速度較快，針對新冠病毒的預(yù)防具有較好的開發(fā)前景。值得注意的是，新出現(xiàn)的證據(jù)顯示，SARS-CoV感染的可能存在抗體依賴性增強(qiáng)(ADE)，提示研制冠狀病毒疫苗時(shí)應(yīng)特別重視安全性評價(jià)。

國內(nèi)的首個(gè)滅活新冠疫苗來自國藥集團(tuán)中國生物。國藥集團(tuán)中國生物4月14日發(fā)布消息，公司旗下新型冠狀病毒滅活疫苗獲得臨床試驗(yàn)后，一期臨床已在河南焦作地區(qū)開展。

另一方面，由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所陳薇院士團(tuán)隊(duì)和中國康希諾（CanSino）公司聯(lián)合開發(fā)的腺病毒5型（Ad5）載體疫苗也取得了重大進(jìn)展。當(dāng)?shù)貢r(shí)間5月22日晚間，頂級醫(yī)學(xué)期刊《柳葉刀》（The Lancet）刊發(fā)一篇論文，題為“重組腺病毒5型載體COVID-19疫苗的安全性，耐受性和免疫原性：劑量遞增，開放標(biāo)簽，非隨機(jī)，首次人類試驗(yàn)”。陳薇等研究人員報(bào)告了在中國健康成年人中使用的Ad5載體COVID-19疫苗在接種后28天內(nèi)的1期臨床數(shù)據(jù)，初步評估疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。

疫苗設(shè)計(jì)和生產(chǎn)

研究團(tuán)隊(duì)從3名新冠住院患者的支氣管肺泡灌洗樣本及咽喉拭子中分離出3株SARS-CoV-2毒株，用于建立SARS-CoV-2滅活候選疫苗的臨床前體外中和攻毒動物模型。3株新冠毒株分別是：19 ncov-cdc-tan-hb02 (HB02), 19 ncov-cdc-tan-strain03 (CQ01)和19 ncov-cdc-tan-strain04 (QD01)。這3株毒株散布在系統(tǒng)發(fā)育樹的不同位置，表明其對SARS-CoV-2具有較好的代表性。

值得注意的是，所有這些毒株都是從Vero細(xì)胞中分離出來的，并已獲得世界衛(wèi)生組織的疫苗生產(chǎn)認(rèn)證。這些Vero細(xì)胞通過患者的咽喉拭子感染，而不是其他細(xì)胞系，以防止在病毒培養(yǎng)和分離過程中可能發(fā)生的突變。高效增殖和高遺傳穩(wěn)定性是研制滅活疫苗的關(guān)鍵。他們首先發(fā)現(xiàn)在三種病毒株中，HB02株的88個(gè)Vero細(xì)胞復(fù)制效果最佳，產(chǎn)生的病毒產(chǎn)量最高(圖1a)。因此，研究者選擇HB02株進(jìn)一步開發(fā)滅活SARS-CoV-2疫苗(BBIBP-CorV)。HB02株和其他從國內(nèi)和國際來源的SARS CoV-2毒株的全基因組序列的比較表明：HB02毒株與其他病毒株同源，并證明了主要保護(hù)性抗原(刺突蛋白質(zhì))有100%的同源性。這說明具有廣泛對抗各種SARS-CoV-2毒株的潛力(補(bǔ)充圖1和補(bǔ)充圖2)。為了獲得適于高產(chǎn)的病毒培養(yǎng)基，研究者對HB02株進(jìn)行了純化，并在Vero細(xì)胞中傳代產(chǎn)生了P1病毒培養(yǎng)基。將P1培養(yǎng)基在Vero細(xì)胞上進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)、傳代和擴(kuò)增。研究者將經(jīng)過7代適應(yīng)化的毒株(BJ-P-0207)作為生產(chǎn)疫苗的原種子(BJ-P1)。為評價(jià)遺傳穩(wěn)定性，研究者對其再傳代3次，得到P10病毒培養(yǎng)基。通過深度測序分析，我們對HB02株和P10株進(jìn)行了全基因組測序，結(jié)果顯示它們的序列同源性大99.95%。此外，在P10原料病毒的全序列中，包括弗林分裂位點(diǎn)附近也沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸變異，這些結(jié)果表明HB02毒株具有較高的遺傳穩(wěn)定性，有利于進(jìn)一步的發(fā)展。

為了高效制造，研究者建立了基于新型籃式反應(yīng)器載體的BBIBP-CorV的原料生產(chǎn)策略(圖1b)。對Vero細(xì)胞中P7培養(yǎng)基的生長動力學(xué)分析顯示，培養(yǎng)基病毒能夠有效復(fù)制，在感染后48-72小時(shí)(hpi)達(dá)到最高滴度超過7.0 log10 CCID50，感染多重度(MOI)為0.01-0.3(圖1c)。為了滅活病毒產(chǎn)生，研究者在2-8℃，以1:40的比例將丙酸內(nèi)酯與收獲的病毒溶液充分混合。病毒的3批滅活消除了病毒的感染性，驗(yàn)證了滅活過程良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性(圖1d)。Western-blotting分析顯示，疫苗庫中含有病毒結(jié)構(gòu)蛋白(保護(hù)性抗原)(圖1e)。負(fù)染色的電子顯微鏡圖像顯示橢圓形病毒顆粒，直徑約為100 nm(圖1f)。

BBIBP-CorV的免疫原性

為評估BBIBP-CorV的免疫原性，研究者采用不同免疫方案和不同劑量(2、4、8μg/劑)疫苗注射BALB/c小鼠。

單劑量免疫組在第0天(D0)以三種劑量腹腔給藥，分別是高(8 μg/劑)、中(4μg/劑)、低劑量(2μg/劑)的BBIBP-CorV，觀察注射后7、14、21、28天中和抗體(NAb)水平。結(jié)果表明，高、中、低劑量組的血清轉(zhuǎn)化速率在免疫后7天都達(dá)到100%，同時(shí)免疫效果與時(shí)間相關(guān)(圖2,補(bǔ)充表1) 。低、中劑量組的中和抗體水平在7、14和21天顯示顯著的變化，但21天到28天之間無顯著差異。在高劑量組中，僅在7 、14天觀察到顯著變化(圖2a)。

雙劑免疫組采用不同免疫方案(第0天/第7天、第0天/第14天、第0天/第21天分別進(jìn)行免疫)。雙劑量免疫中的高、中、低劑量組在第二次免疫后7天的血清陽性達(dá)到100%(圖2 b,補(bǔ)充表1)。高、中劑量的雙劑免疫方案的免疫原性明顯高于單劑量免疫方案。采用第0天/第21天方案的第二次免疫后7天，其中和抗體水平最高。

研究者還測試了三劑免疫程序的免疫原性。他們在0天、7天和時(shí)14 天在小鼠腹腔接種三種劑量的疫苗，分別是高(8μg /劑)、中(4μg /劑)或低(2μg /劑)疫苗 (圖2c)。在第7、14、21、28天測定各組的中和抗體水平，在第一次免疫后第7天，三組血清轉(zhuǎn)化率均達(dá)到100%(圖2c，補(bǔ)充表1)。

結(jié)果顯示，三劑 (0天/7天/14天)免疫接種方案在第28天時(shí)的中和抗體水平，均高一劑免疫接種方案(圖2a和2c)。此外，他們分析了單劑、雙劑(0天/21天)和3劑(0天/7天/ 14天)免疫接種小鼠采用高、中、低劑量疫苗的中和抗體水平，并在第一次免疫后的28天檢測中和抗體水平，以保持相同的起止點(diǎn)。結(jié)果顯示，三劑量(0天/7天/14天)免疫接種方案的免疫原性高于單劑量和雙劑量免疫接種方案(圖2d)。

接下來他們在兔子、豚鼠、大鼠和小鼠等不同的動物模型中測量BBIBP-CorV的免疫原性。采用單劑量(D0)免疫接種方案對動物進(jìn)行高劑量(8μg/劑)、中劑量(4μg/劑))和低劑量(2μg/劑))疫苗免疫，免疫后21天測定中和抗體水平。結(jié)果表明BBIBP-CorV具有良好的免疫原性，免疫后21天在所有動物模型中血清轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%,(圖2 e,補(bǔ)充表1)。在三劑(0天 / 7天 / 14天)免疫組，食蟹猴、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠接種高(8μg /劑量)中(4μg /劑量)或低(2μg /劑量)劑量的疫苗。免疫后21天在所有動物模型中血清轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。第一次免疫后21天的中和抗體水平表明，在兔和豚鼠模型中三劑(0天/7天/14天)免疫程序的高、中、低劑量下，均高于單劑(0天)免疫程序 (圖2 e 2 f,補(bǔ)充表1)。

非人靈長類動物模型中的保護(hù)作用

研究團(tuán)隊(duì)評估了BBIBP-CorV對恒河猴的免疫原性和保護(hù)作用。

所有的恒河猴在第0天（D0）和第14天（D14）免疫2次。安慰劑組肌肉注射生理鹽水，兩組實(shí)驗(yàn)組肌肉注射低劑量（2μg/劑）或高劑量（8μg/劑）BBIBP-CorV（圖3a）。病毒攻毒前，低劑量組和高劑量組的NAb GMT分別達(dá)到215和256(圖3b)。在D24（第二次免疫后第10天），所有恒河猴在麻醉下經(jīng)氣管注射l06 TCID50的SARS-CoV-2。病毒感染后0 至7天，接種組和安慰劑組的體溫在范圍內(nèi)波動（圖3c，補(bǔ)充圖4a）。

另外,恒河猴在攻毒后血清生化參數(shù)保持不變（補(bǔ)充圖3）,這一結(jié)果表明,接種BBIBP-CorV不會在血清生化參數(shù)方面顯示出副作用。

接下來研究團(tuán)隊(duì)用RT-PCR測定了恒河猴咽喉和肛門拭子的病毒載量。結(jié)果顯示，所有安慰劑組恒河猴在攻毒后整個(gè)評估期間均顯示并維持高病毒載量（圖3d、3e，補(bǔ)充圖4b和4c）。

低劑量組恒河猴咽喉拭子病毒載量則在5dpi時(shí)達(dá)到峰值（5.33 log10拷貝/毫升），7 dpi時(shí)下降至1.12 log10拷貝/毫升，明顯低于安慰劑組。值得注意的是，低劑量組的4只恒河猴中有3只在7 dpi時(shí)已無法檢測病毒載量。而高劑量組4只恒河猴咽喉拭子病毒載量均為陰性。另外，高劑量組4只恒河猴中的2只肛門拭子也未檢測到病毒載量。

7 dpi時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)對所有動物實(shí)施了安樂死，以確定肺組織中的病毒載量并進(jìn)行病理檢查（圖3f、3g）。在低劑量和高劑量組中，所有恒河猴在任何肺葉中均未檢測到病毒載量，這與安慰劑組的結(jié)果有顯著差異（圖3f）。安慰劑組在左肺、右肺和右副肺檢測到高病毒載量，病理組織學(xué)分析為嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎。

然而值得注意的是，在安慰劑組的7個(gè)肺葉切片中，只有3個(gè)被檢測出有感染。論文指出，這可能是因?yàn)椴《驹诜稳~中的感染是動態(tài)變化的。

總的來說，接種BBIBP-CorV疫苗后，所有恒河猴的肺均正常，少數(shù)肺葉有局部輕度組織病理學(xué)改變（圖3g），這說明接種BBIBP-CorV疫苗可有效阻斷猴子SARS-CoV-2感染。

7dpi時(shí)，接受安慰劑治療的恒河猴產(chǎn)生低水平的NAb，滴度為1:16，而高劑量組NAb水平最高可達(dá)1:2048（平均1:860），低劑量組NAb水平最高達(dá)1:1024（平均1:512）（圖3b）。研究指出，這些結(jié)果表明，低劑量和高劑量的BBIBP-CorV對恒河猴SARS-CoV-2具有高效的保護(hù)作用，且沒有觀察到抗體依賴性增強(qiáng)感染。