石正麗等中國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)：進(jìn)化的“軍備競(jìng)賽”（arms race）塑造了病毒及其受體的多樣性。鑒定涉及種間傳播的關(guān)鍵殘基對(duì)于預(yù)測(cè)潛在的病原體、了解病毒如何從野生動(dòng)物向人類躍遷，都是非常重要的。

以前，研究者已經(jīng)在中華菊頭蝠中鑒定出具有不同遺傳特征的SARS相關(guān)冠狀病毒（SARSr-CoV）。而這份最新研究還展現(xiàn)了中華菊頭蝠種群中蝙蝠受體ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2）的高度多樣性。這些ACE2變體支持SARS病毒和SARS相關(guān)冠狀病毒的感染，但對(duì)不同刺突蛋白具有不同的結(jié)合親和力。SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白對(duì)人ACE2擁有更高結(jié)合親和力，顯示這些病毒具有向人類躍遷傳染的能力。ACE2和SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白之間的界面處殘基的正向選擇，表明它們之間存在長(zhǎng)期和持續(xù)的協(xié)同進(jìn)化動(dòng)力學(xué)。因此，持續(xù)監(jiān)視蝙蝠中的這一組病毒對(duì)于預(yù)防下一個(gè)SARS樣疾病非常必要。

以上研究來(lái)自中科院武漢病毒所石正麗團(tuán)隊(duì)與福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院歐陽(yáng)松應(yīng)教授在預(yù)印本平臺(tái) bioRxiv 上發(fā)表的論文：Evolutionary arms race between virus and host drives genetic diversity in bat SARS related coronavirus spike genes。

中華菊頭蝠是SARS病毒的宿主，其體內(nèi)還攜帶多種SARS相關(guān)冠狀病毒。這些病毒具有高度的遺傳多樣性，尤其是病毒的刺突蛋白基因。盡管有著不同程度的變異，一些蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒仍可以利用人類受體ACE2進(jìn)入人體細(xì)胞。研究者推測(cè)，蝙蝠的ACE2受體和SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白之間，有著相互作用，而這驅(qū)動(dòng)了SARS相關(guān)冠狀病毒的遺傳多樣性。

研究者鑒定出了一系列中華菊頭蝠ACE2變異體，這些變異體中有一些與SARS-CoV刺突蛋白有相互作用的多態(tài)位點(diǎn)。攜帶不同刺突蛋白的偽病毒或SARS相關(guān)冠狀病毒，在表達(dá)了蝙蝠ACE2變體的細(xì)胞中有著不同的瞬時(shí)感染效率。通過(guò)測(cè)定SARS病毒、SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白與蝙蝠受體、人類受體分子之間的結(jié)合親和力，能觀察到相關(guān)的結(jié)果。

所有被測(cè)試的蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白與人ACE2的結(jié)合親和力，均高于其對(duì)蝙蝠ACE2的結(jié)合親和力。不過(guò)SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白與人ACE2的結(jié)合親和力，比SARS-CoV刺突蛋白與人ACE的親和力低10倍。

結(jié)構(gòu)建模表明，刺突和ACE2之間的結(jié)合親和力差異可能是由于這兩個(gè)分子界面中某些關(guān)鍵殘基的改變而引起。分子進(jìn)化分析表明，這些殘基處于強(qiáng)的正選擇。

這些結(jié)果表明SARS新冠病毒刺突蛋白和蝙蝠ACE2可能隨著時(shí)間的推移而互相進(jìn)化，并經(jīng)歷彼此的選擇壓力，從而觸發(fā)了進(jìn)化的“軍備競(jìng)賽”動(dòng)力學(xué)。這進(jìn)一步證明了，中華菊頭蝠是SARS相關(guān)冠狀病毒的天然宿主。

冠狀病毒是包膜病毒，包含單股正鏈RNA。該亞科有四個(gè)屬，即α、β、γ和δ。α冠狀病毒和β冠狀病毒起源于蝙蝠或嚙齒動(dòng)物，而γ冠狀病毒和δ冠狀病毒起源于鳥類。自21世紀(jì)初以來(lái)，三種β型冠狀病毒已引起人類嚴(yán)重肺炎暴發(fā)。分別是SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2。

SARS-CoV-2引發(fā)的疫情使人們回想起17年前發(fā)生的SARS疫情。SARS是一種人畜共患病，在接下來(lái)的幾年中，科學(xué)家從中國(guó)和歐洲不同地區(qū)的蝙蝠中檢測(cè)或分離出了具有不同遺傳特征的75種SARS相關(guān)冠狀病毒（SARSr-CoV）。

蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒與人類和果子貍的SARS-CoVs有96％的核苷酸序列相似度，其中可變區(qū)最多的是刺突蛋白（S）和輔助蛋白ORF3和ORF8。此外，研究者已經(jīng)確定了不同蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒基因組中能找到SARS-CoV的所有基因構(gòu)建基塊，這表明SARS病毒的祖先是通過(guò)蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒基因組的重組而來(lái)，其起源于蝙蝠。

病毒感染的第一步是識(shí)別細(xì)胞受體，這也是必不可少的步驟。冠狀病毒的進(jìn)入是由病毒刺突蛋白（Spike，S）和細(xì)胞表面受體之間的特異性相互作用介導(dǎo)，然后病毒與宿主膜之間發(fā)生融合。冠狀病毒刺突蛋白在功能上分為兩個(gè)亞基：細(xì)胞附著亞基（S1）和膜融合亞基（S2）。 S1區(qū)域包含N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（CTD）；兩者均可用于冠狀病毒受體結(jié)合（RBD）。

對(duì)于SARS-CoV，其S1-CTD作為RBD與細(xì)胞的受體即血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)合。冷凍電鏡和晶體結(jié)構(gòu)分析，確定了SARS病毒的S-RBD與人ACE2之間界面中的一些關(guān)鍵殘基。

根據(jù)S蛋白的大小，蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒可以分為兩個(gè)不同的進(jìn)化枝。進(jìn)化枝1包含病毒具有與SARS病毒大小相同的刺突蛋白。而由于5、12或13個(gè)氨基酸缺失，屬于進(jìn)化枝2的病毒其刺突蛋白則比SARS病毒的小。

盡管RBD有所不同，所有進(jìn)化枝1毒株都可以使用ACE2進(jìn)入細(xì)胞，而進(jìn)化枝2毒株則由于上述缺失無(wú)法直接進(jìn)入。這些結(jié)果表明，就基因組相似性和ACE2的使用而言，進(jìn)化枝1的成員很可能是SARS病毒的直接來(lái)源。

ACE2在功能上分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N末端結(jié)構(gòu)域參與SARS-CoV結(jié)合，C末端結(jié)構(gòu)域參與心功能的調(diào)節(jié)。先前的結(jié)果表明，不同來(lái)源的ACE2的C末端結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，而N末端結(jié)構(gòu)域在物種間顯示出更多的多樣性。此前已證明SARS病毒可以利用水鼠耳蝠的ACE2和中華菊頭蝠的ACE2。RBD結(jié)合位點(diǎn)中的微小突變，可將ACE2從對(duì)SARS-CoV結(jié)合不易感轉(zhuǎn)變?yōu)橐赘?。由于屬于進(jìn)化枝1的所有SARS相關(guān)冠狀病毒都可從中華菊頭蝠體內(nèi)提取出來(lái)，而且也都可以利用ACE2，因此研究者提出問題：中華菊頭蝠ACE2中的變異是否可能有導(dǎo)致了蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的多樣性。

研究團(tuán)隊(duì)研究了中華菊頭蝠ACE2基因的多態(tài)性，并通過(guò)分子進(jìn)化分析，蛋白質(zhì)親和力測(cè)定和病毒感染測(cè)定相結(jié)合，評(píng)估了它們對(duì)不同蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白的敏感性和結(jié)合親和力。

結(jié)果表明，SARS相關(guān)冠狀病毒的刺突蛋白多樣性可能會(huì)受到中華菊頭蝠ACE2變體的自然選擇壓力； 在長(zhǎng)期共存期間，SARSr-CoV刺突蛋白可能會(huì)被中華菊頭蝠的ACE2選擇，以維持自身遺傳多樣性并適合中華菊頭蝠的種群。

ACE2基因在中華菊頭蝠種群中表現(xiàn)出高度多態(tài)性

根據(jù)蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的流行情況以及樣品組織的可用性和質(zhì)量，研究者使用來(lái)自三個(gè)?。ê?，廣東和云南）的樣品進(jìn)行ACE2擴(kuò)增。

除了團(tuán)隊(duì)先前測(cè)序過(guò)的蝙蝠ACE2（分別從湖北，廣西和云南收集的樣本ID 832、411和3357）和其他蝙蝠ACE2（GenBank登記號(hào)ACT66275，這是從香港收集的樣本）外，研究者從21只中華菊頭蝠蝠個(gè)體中獲得了ACE2基因序列：湖北有5個(gè)，廣東有9個(gè)，云南有7個(gè)。這些蝙蝠ACE2序列在其物種內(nèi)顯示98-100％的氨基酸同一性，與人ACE2的顯示80-81％的氨基酸同一性。

這些蝙蝠ACE2在N端區(qū)域觀察到了主要變化，包括一些先前已確定與SARS病毒的 S-RBD接觸的殘基。根據(jù)非同義SNP分析鑒定出8個(gè)殘基，包括24、27、31、34、35、38.41和42。這8個(gè)殘基的組合產(chǎn)生了8個(gè)等位基因，包括RIESEDYK，LIEFENYQ，RTESENYQ，RIKSEDYQ，QIKSEDYQ， RMTSEDYQ，EMKT KDHQ和EIKT EIKTKDHQ，分別命名為等位基因1-8。

除了先前研究（等位基因4、7和8）中的ACE2基因型數(shù)據(jù)外，研究者在中華菊頭蝠種群中還鑒定出5個(gè)新的等位基因?！暗任换?”在兩個(gè)省的樣本中有發(fā)現(xiàn)，“等位基因4”在3個(gè)省中有發(fā)現(xiàn)，而其他等位基因似乎在地理上受到限制?？傊?，在廣東發(fā)現(xiàn)了3個(gè)等位基因（4、6和8），云南發(fā)現(xiàn)了4個(gè)等位基因（1、2、4和7），在湖北發(fā)現(xiàn)了3個(gè)等位基因（2、4和5），在廣西和香港分別找到了1個(gè)等位基因。在發(fā)現(xiàn)SARS病毒直接祖先的云南一蝙蝠洞中，研究者發(fā)現(xiàn)了4個(gè)等位基因共存。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明ACE2變異體已經(jīng)在不同地區(qū)的中華菊頭蝠種群中長(zhǎng)期存在。與SARS病毒的S-RBD直接接觸的位點(diǎn)的取代，表明它們?cè)赟ARS病毒的進(jìn)化和傳播過(guò)程中可能具有重要功能。

中華菊頭蝠ACE2變體對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒感染表現(xiàn)出的不同敏感性

為了評(píng)估不同的中華菊頭蝠ACE2分子是否會(huì)影響SARS病毒和蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的進(jìn)入，研究者在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)了中華菊頭蝠的ACE2的變體，并測(cè)試了攜帶不同刺突蛋白的SARS病毒偽型或蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的進(jìn)入效率。

4株蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒按照S1序列可分為4個(gè)基因型。簡(jiǎn)單地說(shuō)，與SARS病毒的刺突蛋白相比，SARS相關(guān)病毒RsWIV1的RBD與SARS病毒具有氨基酸高度同一性；RsWIV16是SARS病毒的近親，在NTD和RBD均表現(xiàn)氨基酸高相似；Rs4231在NTD上與SARS病毒有著高度的氨基酸相似度；而RsSHC014在NTD和RBD區(qū)域與SARS病毒均有差異。

與之前的研究結(jié)果類似：所有四株具有相同基因組背景但不同刺突蛋白的蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒毒株，都可以利用人類ACE2進(jìn)行相似水平的復(fù)制。

然而，它們?cè)谌绾卫弥腥A菊頭蝠ACE2方面存在一些差異。所有測(cè)試病毒都能有效利用等位基因1、2、4、5進(jìn)入。具有相同RBD的RsWIV1和RsWIV16則不能使用來(lái)自廣東的等位基因6(樣本ID 1434)。具有相同RBD的Rs4231和RsSHC014不能分別使用來(lái)自云南和廣東的等位基因7(樣本ID 3357)和等位基因8(樣本ID 1438)。SARS病毒BJ01與WIV1和WIV16的RBD有很高的相似性，能夠在假型感染實(shí)驗(yàn)中使用與Rs4231和RsSHC014相同的蝙蝠ACE2等位基因。

這些結(jié)果表明，病毒進(jìn)入細(xì)胞都受到刺突RBD和中華菊頭蝠 ACE2變異體的影響。

蝙蝠ACE2殘基突變會(huì)影響其與SARS相關(guān)冠狀病毒RBD的結(jié)合親和力

為進(jìn)一步了解SARS病毒和SARS相關(guān)冠狀病毒對(duì)ACE2使用能力不同，研究者表達(dá)了冠狀病毒BJ01、RsWIV1、RsWIV1、RsSHC014的RBD，和3個(gè)中華菊頭蝠的ACE2，分別是等位基因6(樣本1434)，等位基因7(樣本3357)和等位基因2(樣本5720)。

隨后，研究者測(cè)試它們之間的親和力。陽(yáng)性對(duì)照為SARS病毒BJ01的RBD 與人ACE2，陰性對(duì)照為SARS病毒RsWIV1的RBD 與人DPP4。實(shí)時(shí)分析表明，基于平衡解離常數(shù)KD，不同RBD與ACE2的結(jié)合親和力不同。

與病毒感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)1434ACE2(等位基因6)與RsSHC014和BJ01結(jié)合，而與RsWIV1的RBD不結(jié)合；研究還發(fā)現(xiàn)3357ACE2(等位基因7)與RsWIV1結(jié)合，但不與RsSHC014和BJ01的RBD結(jié)合；5720ACE2(等位基因2)被發(fā)現(xiàn)能結(jié)合所有測(cè)試的RBD。所有被測(cè)試的RBD都與人類或蝙蝠ACE2具有很高的結(jié)合親和力。然而，與兩種蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的RBD相比，它對(duì)中華菊頭蝠ACE2的結(jié)合親和力較低。

這些結(jié)果表明，刺突RBD與ACE2的結(jié)合親和力影響病毒的感染能力。

SARS相關(guān)冠狀病毒RBDs與中華菊頭蝠ACE2s相互作用的結(jié)構(gòu)模型

4個(gè)蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒的刺突蛋白大小相同，與SARS-CoV的氨基酸同源性超過(guò)90%，表明這些蛋白具有228個(gè)相似的結(jié)構(gòu)。在本研究中，他們使用中華菊頭蝠ACE2 3357（等位基因7)構(gòu)建了蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒RsSHC014 RBD的結(jié)構(gòu)復(fù)雜模型，并用中華菊頭蝠ACE2 1434(等位基因6)構(gòu)建了蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒RsWIV1 RBD的結(jié)構(gòu)復(fù)雜模型。

這與SARS-CoV RBD與人類ACE2的結(jié)合親和實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。與SARS-CoV RBD和人類ACE2界面的接觸殘基相比，可以觀察到ACE2上的兩個(gè)病毒病毒結(jié)合熱點(diǎn)(hotspot hotspot Lys31和Lys353分別由Glu35和Asp38組成的鹽橋)或附近的變化。如前所述，這兩個(gè)熱點(diǎn)隱藏在疏水環(huán)境中。它們?yōu)椴《?受體結(jié)合相互作用提供了大量的能量，并填補(bǔ)了結(jié)合界面上疏水性疊加238相互作用的關(guān)鍵空隙。

與人ACE2相比，中華菊頭蝠ACE2-3357的兩個(gè)主要?dú)埩糇兓荅35K和Y41H。E35K與RsSHC014 RBD中K31和Arg479的鹽橋斷裂，可能影響它們之間的結(jié)合親和力。41位置的組氨酸可能會(huì)削弱K353- d38鹽橋的支撐力，因?yàn)榻M氨酸比酪氨酸的疏水性更弱，導(dǎo)致其與BJ01 RBD的結(jié)合親和力降低。因此，BJ01和RsSHC014 RBD與中華菊頭蝠ACE2 -3357的結(jié)合親和力較低。

在中華菊頭蝠ACE2-1434中，位置31發(fā)現(xiàn)了蘇氨酸，這與人類ACE2的這個(gè)位置不同，人類的是賴氨酸。雖然K31T的變化導(dǎo)致其不能與Glu35形成鹽橋，但BJ01的RBD c中的Tyr442可以與之形成氫鍵。但RsWIV1 RBD中位于442的絲氨酸則不具備這種功能。

此外，RsSHC014含有一個(gè)位于479的精氨酸，Thr31不能與Glu35形成鹽橋，使Glu35可以與Arg479形成鹽橋，但RsWIV1中的RBD殘基Asn479可能會(huì)導(dǎo)致其失去這一能力。因此，BJ01和RsSHC014 RBD可以與中華菊頭蝠ACE2 -1434結(jié)合，但RsWIV1RBD無(wú)法與中華菊頭蝠的ACE2 -1434結(jié)合。

本研究中所有的中華菊頭蝠 ACE2在82的位置都包含一個(gè)天冬酰胺，而人類ACE2在此位置則是蛋氨酸。M82N的變化引入了一個(gè)不利的親水殘基，削弱了熱點(diǎn)31周圍的疏水網(wǎng)絡(luò)。此外，Asn82引入了一個(gè)糖基化位點(diǎn)，就像在大鼠ACE2中一樣，導(dǎo)致其不能有效支持SARS-CoV感染；ACE2在82位置上的聚糖可能導(dǎo)致空間干擾病毒RBD結(jié)合。

因此，M82N可能對(duì)SARS-CoV及SARS相關(guān)冠狀病毒RBD與中華菊頭蝠ACE2s的相互作用有顯著影響。如前所述，RBD的487殘基與ACE2上的熱點(diǎn)353相互作用。RsWIV1 RBD中含有Asn487, Asn487的極性側(cè)鏈可能與ACE2中Lys353殘基的脂肪族部分發(fā)生不利的相互作用，影響K353與D38的熱點(diǎn)相互作用。

此外，RsSHC014 RBD在位置487含有一個(gè)丙氨酸；Ala 487的小側(cè)鏈不支持熱點(diǎn)353的結(jié)構(gòu)。因此，RsWIV1及RsSHC014 RBD與人類ACE2的結(jié)合親和力均低于BJ01，但與人類ACE2的結(jié)合親和力均高于中華菊頭蝠ACE2，這與病毒感染和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度相符。

SARSr-CoV刺突基因通過(guò)正向選擇與中華菊頭蝠ACE2共同進(jìn)化

為了測(cè)試作用于SARS病毒刺突蛋白和中華菊頭蝠ACE2基因可能存在的選擇壓力，他們使用PAML軟件包的編碼ml程序來(lái)分析單個(gè)密碼子的非同義突變與同義突變的比值(dN/dS比值)。通過(guò)分析了完整的編碼SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白的基因序列，并比對(duì)了來(lái)自中華菊頭蝠樣本的9個(gè)SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白的基因序列。

研究發(fā)現(xiàn)模型允許密碼子在正向選擇(M2a和M8)下進(jìn)化。在模型M8(初始種子值ω(dN / dS) = 1.6,密碼子頻率= F3X4), 20個(gè)密碼子(p > 0.95)以dN / dS > 1的速率正向選擇，根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)顯示，298個(gè)密碼子中有17個(gè)被發(fā)現(xiàn)位于RBD區(qū)域，面向受體ACE2。此外，在SARS-CoV刺突中出現(xiàn)的5個(gè)密碼子(442、472、479、480和487)，此前已被確定對(duì)人類ACE2的結(jié)合親和力有顯著影響。

接下來(lái)，他們通過(guò)比對(duì)本研究獲得的以及從GenBank下載的25個(gè)中華菊頭蝠ACE2基因序列，對(duì)中華菊頭蝠ACE2基因進(jìn)行分析。他們發(fā)現(xiàn)在模型M8中，12個(gè)密碼子(2.3%,p > 0.95)以dN / dS > 1的速率進(jìn)行正向選擇，其中8個(gè)密碼子(31、24、27、34、35、38、41、42)對(duì)應(yīng)于人類ACE2的殘留物，這些密碼子直接參與人類SARS病毒刺突蛋白的接觸。

他們還分析了中菊頭蝠(R. affinis)的ACE2基因，有報(bào)道稱該基因偶爾也能結(jié)合SARS相關(guān)冠狀病毒。利用本研究獲得的23個(gè)來(lái)自中菊頭蝠的ACE2基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)中菊頭蝠ACE2在整個(gè)編碼區(qū)不同個(gè)體間的保守性比中華菊頭蝠ACE2更強(qiáng)，并且沒有觀察到明顯的正向選擇位點(diǎn)(數(shù)據(jù)未顯示)。

此外，通過(guò)查詢單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)，他們發(fā)現(xiàn)人類ACE2基因中的SNPs在整個(gè)編碼區(qū)域隨機(jī)產(chǎn)生。雖然在人類ACE2中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)具有非同義突變(T27A和E35K)的SNP位點(diǎn)，但它們?cè)谌蛉巳褐卸硷@示出罕見的頻率(頻率分別為0.00001和0.00002)。這些結(jié)果表明，在蝙蝠SARS相關(guān)冠狀病毒刺突蛋白與中華菊頭蝠ACE2的交界面發(fā)生了正向選擇。