一、疫源地消毒

（一）適用范圍。

適用于出現(xiàn)猴痘病例后，對(duì)其可能污染的場(chǎng)所和物品進(jìn)行的隨時(shí)消毒和終末消毒。

（二）消毒原則。

1.范圍和對(duì)象確定。

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，確定現(xiàn)場(chǎng)消毒的范圍和對(duì)象。對(duì)病例在住院、轉(zhuǎn)運(yùn)期間可能污染的環(huán)境和物品，進(jìn)行隨時(shí)消毒。對(duì)病例居住或活動(dòng)過(guò)的場(chǎng)所，如居住場(chǎng)所、工作場(chǎng)所、學(xué)習(xí)場(chǎng)所、診療場(chǎng)所、轉(zhuǎn)運(yùn)工具，及其他可能受到污染的場(chǎng)所，在其離開(kāi)后（如住院、轉(zhuǎn)院、出院、死亡）進(jìn)行終末消毒。

2.方法選擇。

（1）診療用品消毒。盡量選擇一次性診療用品，非一次性診療用品應(yīng)首選壓力蒸汽滅菌，不耐熱物品可選擇化學(xué)消毒劑或低溫滅菌設(shè)備進(jìn)行消毒或滅菌。

（2）手消毒。建議使用手消毒劑揉搓雙手進(jìn)行消毒，也可選擇75%乙醇、過(guò)氧化氫等消毒劑。

（3）環(huán)境和物體表面消毒。可選擇含氯消毒劑、二氧化氯、過(guò)氧乙酸、過(guò)氧化氫等消毒劑擦拭、噴灑或浸泡消毒。

（4）衣物、床單等紡織品消毒。可選擇熱力消毒、含氯消毒劑或季銨鹽類消毒劑浸泡等消毒方式。

（三）常見(jiàn)污染對(duì)象的消毒方法。

1.手消毒。

可選用速干手消毒劑，或直接選用75%乙醇進(jìn)行擦拭消毒；醇類過(guò)敏者，可選擇季銨鹽類等有效的非醇類手消毒劑。有肉眼可見(jiàn)污染物時(shí)，應(yīng)先使用洗手液（或肥皂）在流動(dòng)水下按照六步洗手法清洗雙手，然后按上述方法消毒。

2.皮膚、黏膜。

皮膚被污染物污染時(shí)，應(yīng)立即清除污染物，再用一次性吸水材料沾取0.5%碘伏或過(guò)氧化氫消毒劑擦拭消毒3分鐘以上，使用清水清洗干凈；粘膜應(yīng)用大量生理鹽水沖洗或0.05%碘伏沖洗消毒。

3.床單、毛巾、衣服等紡織品。

病例使用的床單、毛巾、衣服等紡織品，無(wú)肉眼可見(jiàn)污染物時(shí)，若需重復(fù)使用，可用流通蒸汽或煮沸消毒30分鐘；或用有效氯500mg/L的含氯消毒劑或1000mg/L的季銨鹽類消毒劑浸泡30分鐘后，按照常規(guī)清洗；或用其他有效的消毒方法。不耐濕的衣物可選用環(huán)氧乙烷或干熱方法進(jìn)行消毒處理。

有分泌物、滲出液、排泄物、血液、體液等污染物時(shí)，建議按醫(yī)療廢物集中處理。

4.餐（飲）具。

病例所使用的碗、盤(pán)、筷、杯等餐（飲）具清除食物殘?jiān)螅蠓邢?0分鐘，或使用有效氯500mg/L的含氯消毒劑浸泡30分鐘后，再用清水洗凈。

5.污染物。

對(duì)病例分泌物、滲出液、排泄物、血液、體液等少量污染物可用一次性吸水材料（如紗布、抹布等）沾取有效氯5000-10000mg/L的含氯消毒劑（或能達(dá)到高水平消毒的消毒濕巾/干巾）小心移除。

對(duì)病例分泌物、滲出液、排泄物、血液、體液等大量污染物應(yīng)使用含吸水成分的消毒粉或漂白粉完全覆蓋，或用一次性吸水材料完全覆蓋后用足量的有效氯5000-10000mg/L的含氯消毒劑澆在吸水材料上，作用30分鐘以上（或能達(dá)到高水平消毒的消毒干巾），小心清除干凈。清除過(guò)程中避免接觸污染物，清理的污染物按醫(yī)療廢物集中處置。

病例的分泌物等應(yīng)有專門容器收集，用有效氯20000mg/L的含氯消毒劑，按物、藥比例1:2浸泡消毒2小時(shí)。

清除污染物后，應(yīng)對(duì)污染的環(huán)境和物體表面進(jìn)行消毒。盛放污染物的容器可用有效氯5000mg/L的含氯消毒劑溶液浸泡消毒30分鐘，然后清洗干凈。

6.地面、墻壁。

有肉眼可見(jiàn)污染物時(shí)，應(yīng)先完全清除污染物再消毒。無(wú)肉眼可見(jiàn)污染物時(shí)，可用有效氯1000mg/L的含氯消毒劑或500mg/L的二氧化氯消毒劑擦拭或噴灑消毒；不耐腐蝕的地面和墻壁，也可用2000mg/L的季銨鹽類消毒劑噴灑或擦拭；消毒作用時(shí)間不少于30分鐘。

7.物體表面。

診療設(shè)施設(shè)備表面以及床圍欄、床頭柜、家具、門把手、衛(wèi)生潔具和家居用品等有肉眼可見(jiàn)污染物時(shí)，應(yīng)先完全清除污染物再消毒。無(wú)肉眼可見(jiàn)污染物時(shí)，用有效氯1000mg/L的含氯消毒劑或500mg/L的二氧化氯消毒劑，不耐腐蝕的物體表面也可用2000mg/L的季銨鹽類消毒劑進(jìn)行噴灑、擦拭或浸泡消毒，作用30分鐘后清水擦拭干凈。

8.污水和糞便。

在進(jìn)入市政排水管網(wǎng)前需進(jìn)行消毒處理，消毒后污水應(yīng)當(dāng)符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB18466-2005）。

9.病例生活垃圾。

病例生活垃圾按醫(yī)療廢物處理。

10.醫(yī)療廢物。

醫(yī)療廢物的處置應(yīng)遵循《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》的要求，規(guī)范使用雙層黃色醫(yī)療廢物收集袋封裝后，按常規(guī)流程進(jìn)行處置。

11.室內(nèi)空氣。

如經(jīng)科學(xué)評(píng)估，需對(duì)室內(nèi)空氣進(jìn)行消毒，則在無(wú)人情況下，可選擇5000mg/L過(guò)氧乙酸、3%過(guò)氧化氫、二氧化氯（濃度按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)）等消毒劑，按20mL/m3用超低容量（氣溶膠）噴霧法進(jìn)行消毒。也可采用經(jīng)驗(yàn)證安全有效的其他消毒方法。

二、注意事項(xiàng)

現(xiàn)場(chǎng)消毒應(yīng)確保所用消毒產(chǎn)品合法有效，所選消毒方法科學(xué)可行?，F(xiàn)場(chǎng)消毒時(shí)，根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)情況和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，選擇合格有效的個(gè)人防護(hù)裝備，在做好個(gè)人防護(hù)的前提下，嚴(yán)格按照工作方案實(shí)施消毒。

消毒實(shí)施單位應(yīng)具備現(xiàn)場(chǎng)消毒能力，操作人員應(yīng)經(jīng)過(guò)消毒專業(yè)培訓(xùn)，掌握消毒和個(gè)人防護(hù)基本知識(shí)，熟悉消毒器械的使用和消毒劑的配制等。

每次開(kāi)展消毒工作時(shí)均應(yīng)做好消毒記錄，包括消毒對(duì)象、消毒面積（體積）、消毒劑濃度（或消毒器械強(qiáng)度）、劑量、作用時(shí)間等。同時(shí)，相關(guān)部門和單位應(yīng)做好消毒工作的監(jiān)督管理和評(píng)價(jià)。

附件6

猴痘個(gè)人防護(hù)指南

為加強(qiáng)公眾、疫情處置相關(guān)工作人員和醫(yī)務(wù)人員的個(gè)人防護(hù)，避免猴痘病毒暴露感染，制定本指南。

一、居家隔離治療的病例等相關(guān)人員

（一）適用范圍。

適用于居家隔離治療的病例（疑似病例和確診病例）、照護(hù)人員或共同居住者的個(gè)人防護(hù)。

（二）居家隔離區(qū)域要求。

1.應(yīng)選擇有自然通風(fēng)、獨(dú)立衛(wèi)生間的房間作為隔離區(qū)域。

2.應(yīng)配備專用的餐具，床單、毛巾等床上用品，消毒劑和口罩等個(gè)人防護(hù)用品，電視和平板電腦等電子設(shè)備。

3.衛(wèi)生間宜配備專用的洗衣機(jī)，地漏應(yīng)有水封。

（三）病例管理要求。

1.應(yīng)能夠進(jìn)行自我照護(hù)。

2.應(yīng)每天做好體溫測(cè)量和癥狀監(jiān)測(cè)，避免與他人共用個(gè)人物品。

3.避免與他人發(fā)生性接觸，避免與免疫力低下人員、兒童、老人、孕婦及其他人員的直接接觸，避免與寵物等動(dòng)物接觸，避免捐獻(xiàn)血液等。

4.外出就診時(shí)，應(yīng)佩戴醫(yī)用外科口罩，著長(zhǎng)衣長(zhǎng)褲，確保遮住所有損傷皮膚，避免與他人密切接觸，避免乘坐公共交通工具。

（四）照護(hù)人員要求。

1.應(yīng)每天做好體溫測(cè)量和癥狀監(jiān)測(cè)。

2.應(yīng)盡量避免進(jìn)入隔離區(qū)域。如需進(jìn)入隔離區(qū)域，應(yīng)佩戴醫(yī)用外科口罩和一次性手套，與病例保持至少1米的距離。在離開(kāi)隔離區(qū)域之后，應(yīng)加強(qiáng)手衛(wèi)生，并對(duì)脫下的口罩和手套進(jìn)行消毒處理后廢棄。

3.在拿放和清洗居家隔離治療病例的床單、衣服和處理垃圾的過(guò)程中，應(yīng)避免抖動(dòng)。用濕拖布拖地，避免干掃。用濕抹布清潔家居用品表面，地毯應(yīng)用蒸汽清洗，避免使用吸塵器。

4.應(yīng)將居家隔離治療病例的餐具、床單、毛巾和衣物單獨(dú)洗滌和消毒，可選擇熱力消毒、含氯消毒劑或季銨鹽類消毒劑浸泡等消毒方式。

（五）應(yīng)急處置。

1.照護(hù)人員或共同居住者出現(xiàn)任何癥狀或不適表現(xiàn)，應(yīng)當(dāng)及時(shí)前往指定醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診并主動(dòng)報(bào)告可疑接觸史。

2.對(duì)其接觸的物品、活動(dòng)的區(qū)域等結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果進(jìn)行消毒處理。

二、疫情處置相關(guān)工作人員

（一）適用范圍。

適用于猴痘疫情期間流行病學(xué)調(diào)查、環(huán)境清潔消毒人員的個(gè)人防護(hù)。

（二）流行病學(xué)調(diào)查人員防護(hù)要求。

1.個(gè)人防護(hù)裝備。一次性乳膠手套、醫(yī)用外科口罩、一次性隔離衣等。

2.個(gè)人防護(hù)要求。規(guī)范佩戴口罩，加強(qiáng)手衛(wèi)生，與被調(diào)查人員保持至少1米的距離。

3.廢物管理。調(diào)查結(jié)束后，廢棄的個(gè)人防護(hù)裝備暫存、處理和處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》執(zhí)行。

4.應(yīng)急處置。如在調(diào)查過(guò)程中出現(xiàn)口罩脫落、直接接觸了病例皮膚或分泌物等情況，要結(jié)合被調(diào)查人員的臨床診斷結(jié)果、空間的密閉性、接觸的時(shí)間和距離等進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，采取相應(yīng)的處置措施。

（三）環(huán)境清潔消毒人員防護(hù)要求。

1.個(gè)人防護(hù)裝備。一次性乳膠手套、醫(yī)用外科口罩、一次性隔離衣、防水靴套等。

2.個(gè)人防護(hù)要求。規(guī)范佩戴口罩，加強(qiáng)手衛(wèi)生，盡量減少與被消毒物品的直接接觸。

3.廢物管理。清潔消毒結(jié)束后，廢棄的個(gè)人防護(hù)裝備暫存、處理和處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》執(zhí)行。

4.應(yīng)急處置。如在清潔消毒過(guò)程中出現(xiàn)口罩脫落、皮膚損傷或直接接觸排泄物、血液等情況，要結(jié)合被清潔消毒物品的類型、接觸的時(shí)間和空間的密閉性等進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，采取相應(yīng)的處置措施。

三、醫(yī)務(wù)人員的個(gè)人防護(hù)

（一）適用范圍。

適用于猴痘疫情期間醫(yī)務(wù)人員及其工作環(huán)境的防護(hù)。

（二）基本要求。

1.個(gè)人防護(hù)裝備要求。醫(yī)務(wù)人員執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防，采取經(jīng)接觸傳播和經(jīng)飛沫傳播疾病的隔離與預(yù)防措施，佩戴一次性乳膠手套、KN95/N95及以上級(jí)別的口罩、防護(hù)面屏或護(hù)目鏡、一次性隔離衣等。

2.環(huán)境防護(hù)要求。醫(yī)院環(huán)境的清潔消毒應(yīng)符合附件5的要求。應(yīng)避免干除塵、清掃或吸塵等活動(dòng)。首選濕式清潔方法。

3.廢物管理。個(gè)人防護(hù)裝備、病例敷料等暫存、處理和處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》執(zhí)行。

附件7

猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南

為指導(dǎo)各級(jí)疾控部門和其他相關(guān)機(jī)構(gòu)規(guī)范開(kāi)展猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，快速、準(zhǔn)確識(shí)別猴痘確診病例，制定本指南。本指南主要介紹標(biāo)本采集以及猴痘病毒核酸熒光定量PCR檢測(cè)方法、生物安全要求等內(nèi)容。

一、檢測(cè)對(duì)象

（一）猴痘確診病例和疑似病例；

（二）密切接觸者；

（三）感染或疑似感染猴痘病毒的動(dòng)物；

（四）環(huán)境或其它生物材料。

二、技術(shù)人員基本要求

（一）采樣人員。從事猴痘病毒核酸檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)，培訓(xùn)合格后方可從事采樣工作。采樣人員應(yīng)熟悉采集標(biāo)本種類和采集方法，熟練掌握標(biāo)本采集操作流程及注意事項(xiàng)，做好標(biāo)本信息記錄，確保標(biāo)本質(zhì)量符合要求、標(biāo)本及相關(guān)信息可追溯。

1.采樣人員個(gè)人防護(hù)裝備要求：KN95/N95及以上級(jí)別的口罩、防護(hù)面屏或護(hù)目鏡、一次性隔離衣、一次性乳膠手套（盡可能戴兩層）、靴套；如果接觸了病例血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時(shí)更換手套。污水采樣人員可根據(jù)實(shí)際工作需要，適當(dāng)降低防護(hù)級(jí)別。

2.住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員采集，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，可結(jié)合病程多次采樣。

3.密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)或醫(yī)療機(jī)構(gòu)專業(yè)人員采集。

4.感染或疑似感染猴痘病毒的動(dòng)物由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)協(xié)調(diào)動(dòng)物疫控部門專業(yè)采樣人員負(fù)責(zé)采集。

5.環(huán)境或其它生物材料標(biāo)本由相關(guān)專業(yè)采樣人員負(fù)責(zé)采集。

（二）檢測(cè)人員。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)具備相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷或具有中級(jí)及以上專業(yè)技術(shù)資格，并有2年以上實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)歷，接受過(guò)核酸檢測(cè)相關(guān)培訓(xùn)，培訓(xùn)合格后方可從事檢測(cè)工作。實(shí)驗(yàn)室配備的工作人員數(shù)量應(yīng)與所開(kāi)展檢測(cè)項(xiàng)目及標(biāo)本量相適宜，確保能夠及時(shí)、熟練、準(zhǔn)確地開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和報(bào)告結(jié)果。

三、標(biāo)本采集、保存和運(yùn)輸

（一）標(biāo)本采集種類。

1.首選標(biāo)本是皮膚（黏膜）病變部位標(biāo)本，包括病變表面拭子、痘皰液或痘皰滲出物拭子、痘痂或痘痂拭子等。

2.呼吸道標(biāo)本，如口咽拭子，可用于病例急性期檢測(cè)，也是密切接觸者檢測(cè)最常用標(biāo)本。

3.發(fā)病急性期可采集EDTA抗凝血標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)。

4.采集發(fā)病后7天內(nèi)（急性期）、3-4周后（恢復(fù)期）雙份血清用于抗體檢測(cè)。

5.直腸拭子、尿液、精液、唾液等其它標(biāo)本僅用于研究，根據(jù)工作需要采集。

6.污水或其它環(huán)境生物材料標(biāo)本根據(jù)實(shí)際工作需要進(jìn)行采集。

（二）標(biāo)本采集要求。

采集皮膚（黏膜）病變部位標(biāo)本時(shí)應(yīng)使用無(wú)菌聚酯纖維、尼龍或類似材質(zhì)拭子，避免使用棉拭子。采集疑似病例的標(biāo)本前應(yīng)避免使用75%乙醇等消毒劑清潔病變部位。每種類型的皮膚（黏膜）病變應(yīng)盡可能采集兩個(gè)以上拭子，每個(gè)病例應(yīng)同時(shí)采集身體不同部位或外觀不同的2-3種病變標(biāo)本。采集皮膚（黏膜）病變部位標(biāo)本時(shí)應(yīng)適當(dāng)用力。皮膚（黏膜）病變部位、痘痂或分泌物等不同拭子標(biāo)本應(yīng)放置于不同的采樣管中。進(jìn)行病毒分離時(shí)應(yīng)采集干拭子標(biāo)本（無(wú)采樣液）或以非滅活型病毒采樣液保存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)資質(zhì)確定使用非滅活型或滅活型采樣液采集標(biāo)本。

（三）標(biāo)本采集方法。

1.斑疹、丘疹、水皰或膿皰等皮膚（黏膜）病變部位標(biāo)本：一手緊握采樣拭子尾部，手與拭子頭部保持一寸以上距離。采樣時(shí)適當(dāng)用力下壓拭子，在皮損表面來(lái)回擦拭至少2-3次，然后以拭子另一面再重復(fù)擦拭2-3次。如果在擦拭過(guò)程中痘皰破裂，要確保采集到痘皰液。采樣后將拭子放置于無(wú)菌采樣管中（可含病毒采樣液或不含液體），折斷拭子頭，去除拭子尾部，蓋上管蓋，以消毒紙巾擦拭消毒采樣管，以封口膜密封管蓋后將采樣管保存或送檢。

2.痘痂或痘皰皮膚（黏膜）標(biāo)本：采樣前應(yīng)確保實(shí)驗(yàn)室可檢測(cè)此類標(biāo)本。使用無(wú)菌鑷子或其他鈍頭器械夾取全部痘痂或面積至少4mm×4mm大小的痂皮，放置于干燥、無(wú)菌的采樣管中，采樣完成后以創(chuàng)可貼覆蓋患處。

3.口咽拭子標(biāo)本：被采集人員頭部微仰，嘴張大，露出兩側(cè)扁桃體，將拭子越過(guò)舌根，在被采集者兩側(cè)扁桃體稍微用力來(lái)回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2-3mL病毒保存液的管中或置于不含液體（干拭子）的無(wú)菌管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

4.血液標(biāo)本：盡量采集急性期（發(fā)病7天內(nèi)）的血液標(biāo)本，建議使用含EDTA抗凝劑的真空采血管采集5mL全血，可利用全血進(jìn)行檢測(cè)，或室溫靜置30分鐘后，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血漿于無(wú)菌管中進(jìn)行檢測(cè)。

5.血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5mL，室溫靜置30分鐘，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血清于無(wú)菌螺口塑料管中。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3-4周采集，采集血液標(biāo)本5mL后室溫靜置30分鐘，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血清于無(wú)菌螺口塑料管中，用于猴痘抗體檢測(cè)。

6.其他標(biāo)本：依據(jù)設(shè)計(jì)需求規(guī)范采集。

（四）標(biāo)本保存。

標(biāo)本應(yīng)在收集后1小時(shí)內(nèi)冷藏（2-8℃）或冷凍（-20℃或以下），并盡快進(jìn)行檢測(cè)?？稍?周內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃環(huán)境中保存；1周內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的標(biāo)本，短期可置于-20℃環(huán)境中保存，長(zhǎng)期應(yīng)置于-70℃或以下環(huán)境中保存。全血分離血漿前冷藏（2-8℃），分離出的血漿置于-20℃或以下環(huán)境中保存。應(yīng)設(shè)立專庫(kù)或?qū)９駟为?dú)保存標(biāo)本，避免反復(fù)凍融標(biāo)本。

猴痘病毒及其相關(guān)標(biāo)本應(yīng)由專人管理，準(zhǔn)確記錄病毒及標(biāo)本的來(lái)源、編號(hào)、數(shù)量等信息，具體要求可參考《病原微生物菌（毒）種保藏?cái)?shù)據(jù)描述通則》（T/CPMA 011-2020）。應(yīng)采取有效措施確保病毒及標(biāo)本安全，嚴(yán)防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。

（五）標(biāo)本送檢。

標(biāo)本采集后應(yīng)盡快在低溫條件下（冰袋或干冰）送往實(shí)驗(yàn)室，如需長(zhǎng)途運(yùn)輸標(biāo)本，應(yīng)采用干冰冷凍運(yùn)輸方式進(jìn)行保藏。

1.送檢標(biāo)本：病例標(biāo)本先由省級(jí)及以下疾控機(jī)構(gòu)進(jìn)行初步檢測(cè)，各省首例猴痘陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)送中國(guó)疾控中心病毒病所復(fù)核。每個(gè)陽(yáng)性病例至少采集一套標(biāo)本（皮膚或黏膜病變部位標(biāo)本、口咽拭子標(biāo)本及急性期、恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本）送中國(guó)疾控中心病毒病所檢測(cè)。各省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)根據(jù)實(shí)際情況制定省內(nèi)樣本送檢、復(fù)核流程。

2.病原體及標(biāo)本運(yùn)輸：

（1）國(guó)內(nèi)運(yùn)輸。猴痘病毒或其他潛在感染性生物材料的運(yùn)輸包裝分類屬于A類，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN2814，包裝符合國(guó)際民航組織文件Doc9284《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的PI602分類包裝要求，通過(guò)其他交通工具運(yùn)輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。猴痘病毒或其他潛在感染性材料運(yùn)輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號(hào)）辦理《準(zhǔn)運(yùn)證書(shū)》。污水等環(huán)境標(biāo)本暫按普通生物樣本運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

（2）國(guó)際運(yùn)輸。猴痘毒株或樣本在國(guó)際間運(yùn)輸?shù)?，?yīng)規(guī)范包裝，按照《出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關(guān)手續(xù)，并滿足相關(guān)國(guó)家和國(guó)際相關(guān)要求。

四、猴痘病毒核酸檢測(cè)要求及流程

（一）實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)要求。

開(kāi)展猴痘病毒核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)當(dāng)符合《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院令第424號(hào)）或《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)）有關(guān)規(guī)定，具備設(shè)區(qū)的市級(jí)衛(wèi)生健康部門備案的生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室及以上實(shí)驗(yàn)室條件，并備案猴痘病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。獨(dú)立設(shè)置的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)符合《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本標(biāo)準(zhǔn)（試行）》《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（試行）》等要求。

開(kāi)展猴痘病毒分離、培養(yǎng)、中和等涉及病毒擴(kuò)增、使用等實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備國(guó)家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)的生物安全三級(jí)（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室及以上實(shí)驗(yàn)室條件，且獲得猴痘病毒實(shí)驗(yàn)活動(dòng)批準(zhǔn)。分離的猴痘病毒應(yīng)送國(guó)家病原微生物保藏中心/國(guó)家病原微生物資源庫(kù)病毒分庫(kù)保藏。

（二）實(shí)驗(yàn)室生物安全要求。

根據(jù)2006年公布實(shí)施的《人間傳染的病原微生物名錄》（簡(jiǎn)稱《名錄》），猴痘病毒生物危害分類為第一類，是一種高致病性病毒。按照《名錄》要求，猴痘病毒的分離、培養(yǎng)等涉及病毒擴(kuò)增及使用的實(shí)驗(yàn)操作需在BSL-3及以上實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；非滅活采樣液采集的猴痘病例樣本的滅活在BSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；樣本滅活后猴痘病毒DNA提取、檢測(cè)可在BSL-2及以上實(shí)驗(yàn)室或PCR檢測(cè)的專門區(qū)域或房間進(jìn)行。如《名錄》更新，開(kāi)展猴痘病毒操作的實(shí)驗(yàn)室生物安全要求應(yīng)按最新《名錄》執(zhí)行。污水樣本的滅活參照普通生物樣本。

（三）實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求。

原則上開(kāi)展猴痘病毒核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)。三個(gè)區(qū)域在物理空間上應(yīng)完全相互獨(dú)立，空氣應(yīng)定向流通。各區(qū)功能分別是：

1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的制備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。

2.標(biāo)本制備區(qū)：轉(zhuǎn)運(yùn)桶開(kāi)啟、標(biāo)本滅活，核酸提取及加入至擴(kuò)增反應(yīng)管等。

3.擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)：核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析。

根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。如采用標(biāo)本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。

（四）主要儀器設(shè)備。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)配備與開(kāi)展檢驗(yàn)項(xiàng)目相適宜的儀器設(shè)備，包括：二級(jí)生物安全柜、高速臺(tái)式離心機(jī)、干浴恒溫器、熒光定量PCR儀、計(jì)時(shí)器、移液器。

（五）實(shí)驗(yàn)室猴痘病毒核酸檢測(cè)流程。

實(shí)驗(yàn)室接到標(biāo)本后，按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本前處理、核酸提取、核酸擴(kuò)增、結(jié)果分析及報(bào)告。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立可疑標(biāo)本和陽(yáng)性標(biāo)本復(fù)檢流程。

1.試劑與材料。

（1）標(biāo)本：包括病變表面拭子、痘皰液或痘皰滲出液拭子、痘痂或痘痂拭子、咽拭子、全血或血漿等標(biāo)本。

（2）核酸提取試劑盒（基因組DNA提取試劑盒）：組織基因組DNA提取試劑盒或血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒。

（3）核酸檢測(cè)試劑：

①試劑：DNA聚合酶或預(yù)混的PCR反應(yīng)試劑（PCR Master Mix）。

②猴痘病毒檢測(cè)引物、探針:

③陽(yáng)性對(duì)照：涵蓋檢測(cè)靶標(biāo)序列的質(zhì)粒。

（4）滅菌去離子水、無(wú)水乙醇

（5）消毒液

①75%乙醇：用于手部和物體表面常規(guī)消毒，開(kāi)啟后有效期為1周。

②含氯消毒液：現(xiàn)用現(xiàn)配，含有效氯1000mg/L的消毒液用于物體表面常規(guī)消毒，含有效氯5000mg/L的消毒液用于感染性材料溢灑時(shí)的應(yīng)急處理。

（6）耗材：包括帶濾芯的吸頭、螺旋口的離心管、非螺旋口的離心管、含鋯珠的粉碎管、PCR反應(yīng)板和透明封膜或PCR反應(yīng)管和透明蓋。

（7）BSL-2個(gè)人防護(hù)用品：包括KN95/N95口罩及以上級(jí)別的口罩、一次性隔離衣、防護(hù)眼罩或面屏、一次性帽子、鞋套、靴套和手套。

2.實(shí)驗(yàn)前的標(biāo)本接收。

（1）核對(duì)被檢標(biāo)本編號(hào)、姓名、性別、年齡及檢測(cè)項(xiàng)目；

（2）待檢標(biāo)本的狀態(tài)如有異常，需注明；

（3）待檢標(biāo)本長(zhǎng)期存放在-70℃，短期存放可在-20℃，避免反復(fù)凍融。

3.核酸檢測(cè)操作步驟及注意事項(xiàng)。

（1）病毒核酸（DNA）的制備

操作方法按DNA提取試劑盒相應(yīng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，具體如下：

①提取試劑準(zhǔn)備：第一次開(kāi)啟試劑盒，在使用前先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積參照瓶上標(biāo)簽。所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫；所有離心步驟應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

②處理樣本：

A.痘皰液：干拭子標(biāo)本需以適當(dāng)體積的含PS的PBS或DMEM重懸后檢測(cè)。取100μL樣本，加入80μL緩沖液，總量為180μL；標(biāo)本體積不足100μL時(shí)用緩沖液補(bǔ)足總體積至180μL；

B.病變皮疹或痘痂：取1塊痂皮按質(zhì)量/體積（1mg/50μL）加入相應(yīng)體積含PS的PBS，研磨或勻漿處理，取80μL，然后加入100μL緩沖液；

C.咽拭子、其它拭子：從采樣液中取200μL標(biāo)本，干拭子標(biāo)本可用3mL含PS的PBS或DMEM重懸，混勻后取200μL；

D.全血或血清：直接取200μL標(biāo)本。

③加入20μL蛋白酶K溶液，混勻，溶液會(huì)變清亮。若樣本為病變皮疹或其它組織時(shí)，加入蛋白酶K混勻后，在56℃放置，直至組織溶解，再進(jìn)行下一步驟。

④加入200μL裂解緩沖液，充分混勻，70℃放置10分鐘，或至溶液變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。

需注意：加入裂解緩沖液后可能會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在70℃放置后會(huì)消失。如溶液未變清亮，說(shuō)明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少或提取出的DNA不純。

⑤加200μL無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。

⑥將上一步驟所得溶液和絮狀沉淀均加至吸附柱中（吸附柱放入廢液收集管中），8000rpm離心1分鐘，棄廢液。

⑦加入500μL漂洗緩沖液1（使用前先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），8000rpm離心1分鐘，棄廢液。

⑧加入500μL 漂洗緩沖液2（使用前先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），最大轉(zhuǎn)速13000rpm離心3min，棄廢液。

⑨將吸附柱放回廢液收集管中，最大轉(zhuǎn)速13000rpm離心1分鐘，盡量去除漂洗液。

⑩將吸附柱轉(zhuǎn)入一根干凈的離心管中(需自行準(zhǔn)備，試劑盒中未提供)，加入50μL洗脫緩沖液或滅菌去離子水，室溫放置2-5分鐘，8000rpm離心1分鐘。收集濾出液，做好標(biāo)記，4℃或-20℃（短期）保存?zhèn)溆茫?70℃長(zhǎng)期保存。

（2）核酸檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法檢測(cè)猴痘病毒核酸（PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行）。

①反應(yīng)體系的準(zhǔn)備：每孔20μL，加入5μL樣本DNA，共計(jì)25μL；每次PCR反應(yīng)，除檢測(cè)標(biāo)本外，應(yīng)加無(wú)DNA對(duì)照（用水代替DNA）、陽(yáng)性對(duì)照；所有樣本，包括對(duì)照，應(yīng)設(shè)復(fù)孔。

②加樣: 每根反應(yīng)管中加入核酸或?qū)φ崭?uL，蓋緊管蓋或封好透明膜，置于熒光定量PCR檢測(cè)儀上。

③擴(kuò)增條件設(shè)定：

④儀器檢測(cè)通道選擇:使用熒光定量PCR檢測(cè)儀，選擇Fam熒光信號(hào)檢測(cè)通道，收集設(shè)在60℃。具體設(shè)置方法參照各儀器使用說(shuō)明書(shū)。

⑤結(jié)果分析閾值設(shè)定:使用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，基線取3-10或6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定原則為閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線最高點(diǎn)，也可根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整閾值。

（3）核酸檢測(cè)結(jié)果判斷

①Real-time PCR反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制:反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下2個(gè)條件，否則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新開(kāi)展檢測(cè)。陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，為陰性。陽(yáng)性對(duì)照未出現(xiàn)陰性結(jié)果。

②結(jié)果判定：

A.陰性：雙孔Ct值＞37，或無(wú)Ct值；

B.灰區(qū)：一孔Ct值＞37；

C.陽(yáng)性：雙孔Ct值＜37。

所有陽(yáng)性和處于灰區(qū)的標(biāo)本應(yīng)重復(fù)檢測(cè)或經(jīng)序列分析進(jìn)行確診。需注意：當(dāng)標(biāo)本僅為咽拭子或血清、血漿，且檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，慎重做出陰性診斷。

（4）表格記錄

做好熒光定量實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)猴痘病毒核酸原始記錄。

五、猴痘病毒全基因組測(cè)序

1.測(cè)序標(biāo)本選取原則。本土疫情中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵病例、感染來(lái)源不明的本土病例、境外輸入病例陽(yáng)性標(biāo)本等。以上標(biāo)本在核酸熒光定量PCR檢測(cè)Ct值≤32時(shí)進(jìn)行測(cè)序（關(guān)鍵樣本除外）。

2.測(cè)序要求。以省為單位確定開(kāi)展猴痘病毒全基因組測(cè)序的機(jī)構(gòu)。建議使用擴(kuò)增子技術(shù)進(jìn)行猴痘病毒全基因組測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控合格后方可用于后續(xù)生物信息分析。二代測(cè)序平臺(tái)覆蓋深度應(yīng)不低于10×，三代測(cè)序平臺(tái)覆蓋深度應(yīng)不低于50×，全基因組測(cè)序覆蓋度應(yīng)不低于98%。數(shù)據(jù)比對(duì)分析推薦參考猴痘基因組NC_063383.1。

各省應(yīng)建立本省輸入、本土病例猴痘病毒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)具備序列對(duì)比分析能力。具備測(cè)序條件的省份要在接收標(biāo)本后48小時(shí)內(nèi)開(kāi)展測(cè)序工作，關(guān)鍵樣本要求實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后1周內(nèi)提供測(cè)序結(jié)果報(bào)告，所有測(cè)序原始數(shù)據(jù)(一般為fastq格式)、組裝序列（一般為fasta格式）和標(biāo)本序列測(cè)定結(jié)果報(bào)告單（見(jiàn)附件7-2）應(yīng)在獲得序列48小時(shí)內(nèi)報(bào)送中國(guó)疾控中心病毒病所進(jìn)行序列匯總、分析。病毒病所應(yīng)將序列分析結(jié)果及時(shí)反饋各省，并將全國(guó)猴痘病毒序列匯總、分析結(jié)果及時(shí)上報(bào)國(guó)家疾控局。

3.分子分型。推薦使用在線分析工具Nextclade（https:// clades.nextstrain.org）對(duì)變異株進(jìn)行分子分型。

附件：

7-1猴痘病毒檢測(cè)標(biāo)本送檢表

7-2猴痘病毒標(biāo)本序列測(cè)定結(jié)果報(bào)告單